창자 장기 배양 시스템은 생체 외와 생체 내 작용의 장점을 결합하여 생체 내 실험에서 복잡한 시험관 내 실험 사이의 중간 실험 단계역할을합니다. 이 기술의 주요 장점은 장 생리학의 보존과 단단한 실험 제어의 조합입니다. 이 방법은 호스트, 미생물 및 환경 구성 요소에 대한 높은 수준의 제어로 특정 자극에 대한 장 반응을 분석하기위한 통찰력을 제공합니다.
절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 석사 학생인 알론 셰메시와 실험실 매니저인 시반 아미드로 박사가 될 것입니다. 시작하려면, 장치 금형 내에서 적절한 위치에 무딘 말단 바늘을 삽입하고 장치 및 뚜껑의 한 세트에 대한 폴리 디메틸실록산 또는 PDMS 믹스의 약 20 그램을 캐스팅. 금형을 진공 챔버에 30분 동안 배치하여 PDMS 믹스에서 기포를 제거한 다음 밤새 55도의 금형을 배양하여 PDMS 중합을 완료합니다.
PDMS가 설정되면 금형에서 바늘을 꺼내 서 조심스럽게 플라스틱 금형에서 배양 장치 와 뚜껑을 해제합니다. 수술 용 블레이드를 사용하여 우물 윤곽선에서 PDMS 잔류물을 제거합니다. 비독성 실리콘 접착제를 사용하여 PDMS 장치와 장치 커버를 75~50mm 마이크로슬라이드의 커버 글래스에 부착하고 부품을 하룻밤 사이에 설정하도록 둡니다.
장치의 매끄러운 면에 접착을 적용합니다. 루멘용 12개, 게이지 바늘 12개, 게이지 바늘 12개, 게이지 바늘 18개 실리콘을 사용하여 모든 바늘을 제자리에 고정하고 하룻밤 도록 하십시오.
입력 주사기를 제거하고 잘 매체가 모든 튜브에서 폐기물 유리로 흘러 나오는지 확인한 다음 입력 주사기를 제거하고 자극이 모든 튜브에서 폐유리로 흘러 나와 다른 자극을 오염시키지 않도록 주의하십시오. 마우스를 희생 한 후, 날카로운 가위와 집게를 사용하여 해부하고 모든 지방과 결합 조직을 절단하여 위장에서 항문까지 소화관을 꺼낼 수 있습니다. 결장절단을 잘라 새 접시에 놓습니다.
조직을 부드럽게 잡고 가장자리에서만 접촉하는 것을 최소화하십시오. 해부 현미경하에서 결장 플러시를 수행합니다. 본문에 설명된 대로 준비된 10 밀리리터 주사기로 멸균 IMDM으로 결장 함량을 부드럽게 플러시합니다.
장 조직에서 대변을 제거 한 후, 멸균 IMDM의 0.5 밀리리터로 채워진 새로운 6 개의 우물 접시에 결장배치. 다음으로, 결장 조직을 가지고 조심스럽게 22 게이지 바늘에 연결하여 두 개의 실과 단단히 묶습니다. 근동 및 탈말이 각각 입력 및 출력과 같을 정도로, 루멘 흐름에 대한 결장의 올바른 방향을 유지한다.
모든 조직에 대한 결장 홍조와 바늘 묶는 반복. 입력 및 출력 튜브를 장치에 연결한 다음 원하는 속도로 펌프를 시작하여 실험을 시작합니다. 루멘 내의 대장 상피 및 점액 분비에서 점액이 채워진 잔 세포는 KI67 염색에 의해 표시된 바와 같이 식민지 토굴에서 IEC를 증식할 뿐만 아니라 검출되었다.
이러한 결과는 창자 배양 시스템이 장 기능 및 구조 전 생체 를 유지한다는 것을 보여주었다. 분할 필라멘트 박테리아, 또는 SFB의 2 시간 후, 소개, 전형적인 SFB 필라멘트는 시투 혼성화에서 형광을 사용하여 소장 빌리와 가까운 연결에서 검출되었다. 추가적으로, 전송 전자 현미경 검사는 소장 상피 브러시 테두리의 몇몇 미크론 안에 SFB를 제시했습니다.
전체 조직 샘플의 유전자 발현 프로파일은 SFB를 주입한 후 2시간 후에 삼중에서 생산되었다. 대조군 배양은 세균이 없거나 박테로이드 의 연약한 단원화 마우스의 배설물 현탁액으로 주입되었다. SFB에 의해 설득된 이러한 변화는 주로 세균없는 제어에 비해 작은 진폭이었다.
결장의 방향은 매우 중요합니다. 바늘에 결장과 묶을 때 주의하십시오. 적절한 넥타이는 루멘 함량으로 우물의 오염을 방지할 수 있습니다.
차세대 시퀀싱, 이미징, 세포 정렬 등과 같은 광범위한 판독 기법이 이 프로토콜을 따를 수 있습니다. 이 판독은 건강과 질병에 있는 호스트 microbiome 상호 작용에 새로운 통찰력을 제공합니다.
