O sistema de cultura de órgãos intestinais combina as vantagens dos ensaios in vitro e in vivo e, portanto, serve como um passo experimental intermediário entre ensaios in vitro simples e complexos. A principal vantagem dessa técnica é a combinação de controle experimental apertado com a preservação da fisiologia intestinal. Este método fornece insights para a análise de respostas intestinais a estímulos específicos com alto nível de controle sobre o hospedeiro, microbiano e os componentes ambientais.
Demonstrando o procedimento estarão Alon Shemesh, um estudante de mestrado do meu laboratório, e o Dr. Sivan Amidror, nosso gerente de laboratório. Para começar, insira as agulhas de ponta bruta na posição apropriada dentro do molde do dispositivo e lance aproximadamente 20 gramas de mistura de polidimometiletilatosiloxano ou PDMS, para um conjunto do dispositivo e da tampa. Coloque os moldes em uma câmara de vácuo por 30 minutos para remover bolhas de ar da mistura PDMS e, em seguida, incubar os moldes a 55 graus Celsius durante a noite para completar a polimerização do PDMS.
Quando o PDMS estiver pronto, retire as agulhas do molde e solte cuidadosamente o dispositivo de cultura e a tampa dos moldes de plástico. Remova os resíduos PDMS do contorno do poço usando uma lâmina cirúrgica. Conecte o dispositivo PDMS e a tampa do dispositivo em um vidro de cobertura de 75 por 50 milímetros de microslides usando adesivo de silício não tóxico e deixe as peças definidas durante a noite.
Aplique o colado no lado liso do dispositivo. Insira 12, 22 agulhas de calibre para o lúmen e 12, 18 agulhas de bitola para o poço. Conserte todas as agulhas no lugar usando silicone e deixe-a definida durante a noite.
Purgue as seringas de entrada e certifique-se de que o meio-poço flua de todos os tubos em um copo de lixo, em seguida, purgar as seringas de entrada e certifique-se de que as estimulações fluem de todos os tubos em um copo de lixo, tomando cuidado para não contaminar as diferentes estimulações. Depois de sacrificar o rato, use tesouras afiadas e fórceps para dissecá-lo e tirar o trato digestivo do estômago para o ânus, cortando toda a gordura e tecidos conjuntivos. Corte o cólon e coloque-o em um prato novo.
Minimize o contato enquanto segura o tecido suavemente e apenas nas bordas. Realize a descarga do cólon sob um microscópio de dissecção. Lave suavemente o teor de cólon com IMDM estéril com a seringa preparada de 10 mililitros, conforme descrito no texto.
Depois de remover as fezes do tecido intestinal, coloque o cólon em uma nova placa de seis poços preenchida com 0,5 mililitros de IMDM estéril. Em seguida, pegue o tecido do cólon e conecte-o cuidadosamente à agulha de calibre 22, fazendo uma gravata apertada com os dois fios. Mantenha a orientação correta do cólon para o fluxo de lúmen, de tal forma que o proximal e distal seja igual à entrada e saída, respectivamente.
Repita a descarga do cólon e a agulha para todos os tecidos. Conecte os tubos de entrada e saída ao dispositivo e inicie o experimento iniciando as bombas nas taxas desejadas. Células de cálice cheias de muco no epitélio colonico e secreção de muco dentro do lúmen foram detectadas, bem como proliferando IEC nas criptas coloniais, como indicado pela coloração ki67.
Esses resultados mostraram que o sistema de cultura intestinal mantém a função intestinal e a estrutura ex-vivo. Após duas horas de bactérias filamentosas segmentadas, ou SFB, introdução, filamentos típicos de SFB foram detectados em estreita associação com o intestino delgado villi usando fluorescência na hibridização situ. Além disso, uma microscopia eletrônica de transmissão apresentou SFB dentro de alguns mícrons da borda do pincel de epitélio do intestino delgado.
Perfis de expressão genética de amostras de tecido inteiro foram produzidos em triplicado duas horas após a infusão com SFB. As culturas de controle foram infundidas com suspensões fecais de camundongos monocolonizados livres de germes ou bacteroides. Essas mudanças persuadidas pela SFB foram principalmente de pequena amplitude em comparação com o controle livre de germes.
A orientação do cólon é muito importante. Tome cuidado extra ao amarrar o cólon na agulha. A gravata adequada evitará a contaminação do poço com o teor de lúmen.
Uma ampla gama de técnicas de leitura pode seguir este protocolo, como sequenciamento de próxima geração, imagem, classificação celular e muito mais. Estas leituras fornecem novas informações sobre interações de microbioma hospedeiro em saúde e doenças.
