El sistema de cultivo de órganos intestinales combina las ventajas de los ensayos in vitro e in vivo y, por lo tanto, sirve como un paso experimental intermedio entre los ensayos in vitro simples y los experimentos in vivo complejos. La principal ventaja de esta técnica es la combinación de un estricto control experimental con la preservación de la fisiología intestinal. Este método proporciona información para analizar las respuestas intestinales a estímulos específicos con un alto nivel de control sobre el huésped, los microbios y los componentes ambientales.
Demostrando el procedimiento estarán Alon Shemesh, un estudiante de maestría de mi laboratorio, y el Dr. Sivan Amidror, nuestro gerente de laboratorio. Para comenzar, inserte las agujas de extremo romo en la posición adecuada dentro del molde del dispositivo y funda aproximadamente 20 gramos de mezcla de polidimetilsiloxano o PDMS, para un juego del dispositivo y la tapa. Coloque los moldes en una cámara de vacío durante 30 minutos para eliminar las burbujas de aire de la mezcla PDMS, luego incube los moldes a 55 grados Celsius durante la noche para completar la polimerización PDMS.
Cuando se configure el PDMS, saque las agujas del molde y suelte cuidadosamente el dispositivo de cultivo y la tapa de los moldes de plástico. Elimine los residuos de PDMS del contorno del pozo con una cuchilla quirúrgica. Coloque el dispositivo PDMS y la cubierta del dispositivo en un vidrio de cubierta de microdeslidas de 75 por 50 milímetros con adhesivo de silicio no tóxico y deje que las piezas se fijen durante la noche.
Aplique el pegado en el lado liso del dispositivo. Inserte 12, 22 agujas de calibre para el lumen y 12, 18 agujas de calibre para el pozo. Fije todas las agujas en su lugar con silicona y déjelo colocar durante la noche.
Purgue las jeringas de entrada y asegúrese de que el medio del pozo fluya desde todos los tubos hacia un vaso de desecho, luego purgue las jeringas de entrada y asegúrese de que las estimulaciones fluyan de todos los tubos hacia un vidrio de desecho, teniendo cuidado de no contaminar las diferentes estimulaciones. Después de sacrificar el ratón, use tijeras afiladas y pórceps para diseccionarlo y sacar el tracto digestivo desde el estómago hasta el ano, cortando toda la grasa y los tejidos conectivos. Corte el colon y colóquelo en un plato nuevo.
Minimice el contacto mientras sostiene el tejido suavemente y solo en los bordes. Realice el lavado del colon bajo un microscopio de disección. Enjuague suavemente el contenido de colon con IMDM estéril con la jeringa preparada de 10 mililitros como se describe en el texto.
Después de extraer las heces del tejido intestinal, coloque el colon en una nueva placa de seis pozos llena de 0,5 mililitros de IMDM estéril. A continuación, tome el tejido del colon y conéctelo cuidadosamente a la aguja de calibre 22, haciendo un lazo apretado con los dos hilos. Mantenga la orientación correcta del colon al flujo de lúmenes, de modo que el proximal y el distal sea igual a la entrada y salida, respectivamente.
Repita el enrojecimiento del colon y el ate con aguja para todos los tejidos. Conecte los tubos de entrada y salida al dispositivo, luego comience el experimento iniciando las bombas a las velocidades deseadas. Se detectaron células caliciformes llenas de moco en el epitelio colónico y secreción de moco dentro de la luz, así como la proliferación de IEC en las criptas colónicas, como lo indica la tinción KI67.
Estos resultados mostraron que el sistema de cultivo intestinal mantiene la función intestinal y la estructura ex-vivo. Después de dos horas de introducción de bacterias filamentosas segmentadas, o SFB, se detectaron filamentos SFB típicos en estrecha asociación con vellosidades del intestino delgado mediante hibridación fluorescente in situ. Además, una microscopía electrónica de transmisión presentó SFB dentro de unas pocas micras del borde del cepillo del epitelio del intestino delgado.
Los perfiles de expresión génica de muestras de tejido entero se produjeron por triplicado dos horas después de la infusión con SFB. Los cultivos de control se infundieron con suspensiones fecales de ratones monocolonizados sin gérmenes o Bacteroides fragilis. Estos cambios persuadidos por SFB fueron principalmente de pequeña amplitud en comparación con el control libre de gérmenes.
La orientación del colon es muy importante. Tenga especial cuidado al atar el colon a la aguja. La amarre adecuada evitará la contaminación del pozo con el contenido de lúmenes.
Una amplia gama de técnicas de lectura pueden seguir este protocolo, como la secuenciación de próxima generación, imágenes, clasificación celular y muchas más. Estas lecturas proporcionan una visión novedosa de las interacciones del microbioma del huésped en la salud y la enfermedad.
