Le système de culture d’organes intestinaux combine les avantages des essais in vitro et in vivo et sert ainsi d’étape expérimentale intermédiaire entre des essais in vitro simples et des expériences in vivo complexes. Le principal avantage de cette technique est la combinaison d’un contrôle expérimental strict avec la préservation de la physiologie intestinale. Cette méthode fournit des informations pour analyser les réponses intestinales à un stimulus spécifique avec un niveau élevé de contrôle sur l’hôte, les composants microbiens et environnementaux.
Alon Shemesh, un étudiant à la maîtrise de mon laboratoire, et le Dr Sivan Amidror, notre directeur de laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Pour commencer, insérez les aiguilles à extrémité émoussée à la position appropriée dans le moule de l’appareil et coulez environ 20 grammes de mélange de polydiméthylsiloxane ou de PDMS, pour un ensemble de l’appareil et du couvercle. Placez les moules dans une chambre à vide pendant 30 minutes pour éliminer les bulles d’air du mélange PDMS, puis incubez les moules à 55 degrés Celsius pendant la nuit pour terminer la polymérisation PDMS.
Lorsque le PDMS est réglé, retirez les aiguilles du moule et libérez soigneusement le dispositif de culture et le couvercle des moules en plastique. Retirez les résidus de PDMS du contour du puits à l’aide d’une lame chirurgicale. Fixez le dispositif PDMS et le couvercle de l’appareil sur un verre de couverture de microslides de 75 par 50 millimètres à l’aide d’un adhésif au silicium non toxique et laissez les pièces se fixer pendant la nuit.
Appliquez le collé sur le côté lisse de l’appareil. Insérez 12, 22 aiguilles de jauge pour la lumière et 12, 18 aiguilles de jauge pour le puits. Fixez toutes les aiguilles en place à l’aide de silicone et laissez-les se fixer pendant la nuit.
Purgez les seringues d’entrée et assurez-vous que le milieu du puits s’écoule de tous les tubes dans un verre usagé, puis purgez les seringues d’entrée et assurez-vous que les stimulations s’écoulent de tous les tubes dans un verre usagé, en prenant soin de ne pas contaminer les différentes stimulations. Après avoir sacrifié la souris, utilisez des ciseaux et des pinces tranchants pour la disséquer et retirer le tube digestif de l’estomac à l’anus, en coupant toute la graisse et les tissus conjonctifs. Coupez le côlon et placez-le sur une nouvelle assiette.
Minimisez le contact tout en tenant le tissu doucement et seulement sur les bords. Effectuez le rinçage du côlon sous un microscope à dissection. Rincez doucement le contenu du côlon avec de l’IMDM stérile avec la seringue préparée de 10 millilitres comme décrit dans le texte.
Après avoir retiré les matières fécales du tissu intestinal, placez le côlon dans une nouvelle plaque de six puits remplie de 0,5 millilitre de DMI stérile. Ensuite, prenez le tissu du côlon et connectez-le soigneusement à l’aiguille de calibre 22, en faisant une cravate serrée avec les deux fils. Maintenez l’orientation correcte du côlon par rapport au flux lumineux, de sorte que le proximal et le distal soient égaux à l’entrée et à la sortie, respectivement.
Répétez le rinçage du côlon et l’attache des aiguilles pour tous les tissus. Connectez les tubes d’entrée et de sortie à l’appareil, puis commencez l’expérience en démarrant les pompes aux vitesses souhaitées. Des cellules de gobelet remplies de mucus dans l’épithélium colique et une sécrétion de mucus dans la lumière ont été détectées ainsi qu’une prolifération de ceI dans les cryptes du côlon, comme indiqué par la coloration KI67.
Ces résultats ont montré que le système de culture intestinale maintient la fonction et la structure intestinales ex-vivo. Après deux heures d’introduction de bactéries filamenteuses segmentées, ou SFB, des filaments SFB typiques ont été détectés en étroite association avec les villosités de l’intestin grêle en utilisant l’hybridation in situ par fluorescence. De plus, une microscopie électronique à transmission a présenté un SFB à quelques microns de la bordure de la brosse d’épithélium de l’intestin grêle.
Les profils d’expression génique d’échantillons de tissus entiers ont été produits en trois exemplaires deux heures après la perfusion de SFB. Les cultures témoins ont été perfusées avec des suspensions fécales de souris monocolonisées sans germes ou Bacteroides fragilis. Ces changements persuadés par SFB étaient principalement de faible amplitude par rapport au contrôle sans germes.
L’orientation du côlon est très importante. Prenez des précautions supplémentaires lorsque vous attachez le côlon sur l’aiguille. Une bonne attache empêchera la contamination du puits par le contenu en lumens.
Un large éventail de techniques de lecture peuvent suivre ce protocole, telles que le séquençage de nouvelle génération, l’imagerie, le tri cellulaire et bien d’autres. Ces lectures fournissent de nouvelles informations sur les interactions du microbiome de l’hôte dans la santé et la maladie.
