腸器官培養システムは、インビトロおよびインビボアッセイの利点を兼ね備え、単純なインビトロアッセイと複雑なインビボ実験の中間実験ステップとして機能します。この技術の主な利点は、腸生理学の保存と緊密な実験的制御の組み合わせです。この方法は、宿主、微生物、および環境成分を高いレベルで制御することで、特定の刺激に対する腸の応答を分析するための洞察を提供する。
この手順のデモンストレーションは、私の研究室の修士課程の学生であるアロン・シェメシュと、研究室長のシヴァン・アミドラー博士です。まず、デバイスモールド内の適切な位置に鈍端の針を挿入し、デバイスと蓋の1セットに対して約20グラムのポリジメチルシロキサンまたはPDMSミックスを投射します。PDMSミックスから気泡を除去するために30分間真空チャンバーに金型を入れ、その後、PDMS重合を完了するために一晩摂氏55度で金型をインキュベートします。
PDMSが設定されたら、金型から針を引き出し、プラスチック金型から培養装置と蓋を慎重に放出します。外科用ブレードを使用して、井戸の輪郭からPDMS残基を除去します。PDMSデバイスとデバイスカバーを、無毒シリコン接着剤を使用して75~50ミリメートルのマイクロスライドのカバーガラスに取り付け、部品を一晩セットします。
デバイスのスムーズな側に接着を適用します。ルーメン用に12、22ゲージ針、井戸用に12、18ゲージの針を挿入します。シリコーンを使用して所定の位置にすべての針を固定し、一晩に設定してみましょう。
入力シリンジをパージし、井戸媒体がすべてのチューブから廃棄物ガラスに流れ出ることを確認し、入力シリンジをパージし、刺激がすべてのチューブから廃棄物ガラスに流れ出ることを確認し、異なる刺激を汚染しないように注意してください。マウスを犠牲にした後、鋭いはさみと鉗子を使用して解剖し、すべての脂肪と結合組織を切断することによって、胃からアヌスに消化管を取り出します。コロンを切り、新しい皿の上に置きます。
組織を穏やかに、端部にだけ保持しながら接触を最小限に抑えます。解剖顕微鏡下で結腸紅潮を行う。テキストに記載されているように、調製された10ミリリットルの注射器で滅菌IMDMで結腸含有量を静かに洗い流します。
腸組織から便を取り除いた後、0.5ミリリットルの無菌IMDMで満たされた新しい6つのウェルプレートに結腸を置く。次に、結腸組織を取り、慎重に22ゲージ針に接続し、2つの糸でしっかりと結びます。近位と遠位がそれぞれ入力と出力に等しくなるような、ルーメンの流れに対する結腸の正しい方向を維持する。
すべての組織に対して結腸紅潮と針の結び付けを繰り返します。入力および出力チューブをデバイスに接続し、希望の速度でポンプを開始して実験を開始します。粘液で満たされたゴブレット細胞は、KI67染色で示されるように、内腔内の大腸上皮および粘液分泌物中のIECの増殖と同様に検出された。
これらの結果は、腸管培養系が腸機能および構造ex-vivoを維持することを示した。セグメント化された糸状菌、またはSFBの導入の2時間後に、典型的なSFBフィラメントは、その際の蛍光を使用して小腸絨毛と密接に関連して検出された。さらに、トランスミッション電子顕微鏡は、小腸上皮ブラシの境界の数ミクロン以内にSFBを提示した。
組織全体サンプルの遺伝子発現プロファイルは、SFBとの注入の2時間後に三重化で作製した。対照培養物に、胚芽を含まないまたはバクテロイデス・フラジリス単植民地化マウスの便懸濁液を注入した。SFBによって説得されたこれらの変化は、主に無菌制御と比較して小さな振幅であった。
コロンの向きは非常に重要です。針に結びつくときは、細心の注意を払ってください。適切な結びは、内腔の内容との井戸の汚染を防ぐことができます。
このプロトコルには、次世代のシーケンシング、イメージング、セルの並べ替えなど、さまざまな読み出し手法が使用できます。この読み出しは、健康と病気における宿主微生物叢相互作用に関する新しい洞察を提供する。
