Haemophilus influenza ist eine Hauptursache für Entzündungen bei verschiedenen chronischen Lungenerkrankungen wie COPD und Lungenentzündung. Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Beurteilung der Wirkung von Hämophilus auf Lungenentzündungen. Der Vorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine umfassende Beurteilung der angeborenen und adaptiven Immunantwort ermöglicht.
450 Mikroliter peripheres Blut mit 50 Mikrolitern eines aktivierten Propidiumiodids mit der Bezeichnung H influenzae in einem Fünf-Milliliter-Röhrchen für 20 Minuten in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nehmen Sie die Probe aus dem Wasserbad, fügen Sie fünf Mikroliter DHR und Wirbel für 10 Sekunden hinzu. Dann legen Sie es für weitere 10 Minuten wieder in das Wasserbad.
Nach der Entnahme der Probe aus dem Wasserbad lysieren Sie die Erythrozyten mit fünf Milliliter 0,8% Ammoniumchloridlösung und analysieren Sie die Proben auf einem Durchflusszytometer, wie im Text beschrieben. Teilen Sie die periphere Blutprobe zur Kontrolle und Antigenstimulation in Aliquots auf. Fügen Sie beiden Proben kostimulatorische Antikörper hinzu.
Dann das nicht typisierbare H influenzae in die Antigenprobe geben und bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für eine Stunde inkubieren. Als nächstes fügen Sie das Golgi-Blockmittel Brefeldin A zu den Proben hinzu und inkubieren sie für weitere fünf Stunden. Nach dem Lysieren der Erythrozyten, wie zuvor gezeigt, fixieren Sie die Leukozyten mit 500 Mikrolitern von einem bis 2% Para-Formaldehyd für eine Stunde.
Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und permeabilisieren Sie dann 1 Million Zellen mit 100 Mikrolitern 0,1% Saponin für 15 Minuten. Als nächstes inkubieren Sie die Zellen mit geeigneten fluoreszierenden markierten Antikörpern. Waschen Sie die Zellen und analysieren Sie sie dann mit einem Durchflusszytometer.
Bestimmen Sie den Anteil der antigenreagierenden Zellen, indem Sie die relevanten Lymphozytenpopulationen erhalten. Führen Sie eine Hintergrundfärbung an nicht stimulierten Zellen durch, damit alle zu analysierenden Zytokine analysiert werden können. Schneiden Sie etwa 20 bis 40 Gramm der Lobektomieprobe in drei bis fünf Kubikmillimeterabschnitte.
Legen Sie sie in eine sterile 50-Mikroliter-Kammer und fragmentieren Sie das Gewebe mechanisch mit einem geeigneten Disaggregator. Nach der Gewebedisaggregation lysieren Sie die roten Blutkörperchen wie gezeigt und resuspendieren Sie die Zellen in sterilem RPMI. Dann filtern Sie die Zellen durch ein 100 Mikrometer steriles Nylonnetz und zählen Sie die lebensfähigen Zellen mit der Trypanblau-Ausschlussmethode.
Für den Infektionstest resuspendieren Sie die Lungenzellen in RPMI auf eine Endkonzentration von 4 Millionen Zellen pro Milliliter pro Röhrchen. Dann infizieren Sie die Zellen bei einem MOI von 100 Bakterien pro Zelle. Lösen Sie die Kappe eine halbe Umdrehung, um den Gastransfer in den Rohren zu ermöglichen.
Legen Sie die Zellen in den Röhrchenrotator und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius, während sie sich mit 12 U/min drehen. Eine Stunde nach der Stimulation Grefeldin A hinzufügen, um den extrazellulären Export von Zytokinen zu verhindern, und die Zellsuspensionen für weitere 16 bis 22 Stunden mit Rotation inkubieren. Am nächsten Tag wird die Zellsuspension mit 500 Mikrolitern PBS gewaschen, das 1% Rinderserumalbumin und 0,01% Natriumazid enthält.
Als nächstes färben Sie die Zellsuspension für spezifische menschliche Lymphozyten Zelloberflächenmarker für eine Stunde. Dann waschen Sie die Zellen mit PBS und fixieren und permeabilisieren Sie sie, wie zuvor gezeigt. Als nächstes inkubieren Sie die Zellen mit intrazellulären Zytokin-Färbe-Antikörpern für eine Stunde.
Dann waschen Sie die Zellen und resuspendieren Sie sie in 100 Mikroliter PBS, bevor Sie die Daten auf einem Durchflusszytometer erfassen. Messen Sie die Proteolyse über die Wirkung von Metalloproteinasen, fügen Sie fluoresceinmarkiertes Gelatinesubstrat direkt auf die Objektträger des Lungengewebeabschnitts hinzu. Legen Sie die Objektträger horizontal auf und inkubieren Sie sie eine Stunde lang in einer lichtgeschützten Befeuchtungskammer bei 37 Grad Celsius.
Um Negativkontrollen vorzubereiten, fügen Sie den Abschnitten einen x Reaktionspuffer ohne fluoreszierende Gelatine zur weiteren Analyse hinzu. Periphere mononukleäre Blutzellen wurden mit Vorwärts- und Seitenstreuung umgated, um die Phagozytenpopulation zu definieren. Die Phagozytenpopulation wurde weiter durch CD14-Expression definiert, um die Monozyten zu markieren.
Die ROS-Messung wurde durch Oxidation von DHR 123 durchgeführt, um Fluoreszenz zu erzeugen. Die mediane Fluoreszenz der stimulierten Probe wurde mit der Kontrolle verglichen. Die intrazelluläre Zytokinproduktion durch Lymphozyten wurde mittels Durchflusszytometrie gemessen.
Die Zellen wurden zuerst auf ihre Expression des Leukozytenmarkers CD45 und dann auf CD drei und CD vier, CD acht analysiert. Die CD drei, CD vier positiven Zellen wurden auf intrazelluläre Zytokinproduktion in Kontroll- und stimulierten Proben untersucht. Die Proteaseaktivität wurde mittels NC-Zwei-Zymographie in nicht fixierten Lungengewebeschnitten gemessen.
Fluoreszierende Färbung zeigte das Vorhandensein von MMP-Aktivität an, die auch mit der Expression von Chromatin kolokalisiert war. Die Zugabe von Antikörpern zu den Lungengewebeproben erfordert eine Konzentration und die Färbung der Zellen erfordert eine Optimierung in Vorexperimenten. Der Überstand der Lungengewebeproben kann mit Techniken wie ELISA und Diese Techniken können verwendet werden, um die Wirkung potenzieller Therapien auf Lungenentzündungen zu beurteilen.
