Die wiederholte Blutentnahme des kleinen Labortieres ist ein wichtiger Aspekt der pharmazeutischen Bleioptimierung. Dieses Protokoll beschreibt die mikrochirurgischen Fähigkeiten, um ein permanentes Jugularvenen-Kanülierungsrattenmodell zu etablieren. Diese Technik kann effizient ein Jugularvenen-Kanülierungsrattenmodell etablieren und bei bewussten Ratten wiederholt Blutproben durch die Kanüle sammeln, während Stress und Schmerzen vermieden werden.
Es ist wichtig, die Vena jugularis und ihre Kanülierung zu lokalisieren, da die visuelle Demonstration der anatomischen Komplexität für dieses Modell nicht verfügbar ist. Bereiten Sie zunächst die aseptische Workstation mit 75% medizinischem Alkohol vor und betäuben Sie dann die rasierte Ratte mit Isofluran, gemischt mit Sauerstoff. Subkutan injizieren Sie Meloxicam-Lösung in einer Dosis von zwei Milligramm pro Kilogramm, heben Sie dann vorsichtig die Haut in der Nähe des Schlüsselbeins auf der rechten Seite der Mittellinie des Halses mit einer Pinzette an und machen Sie mit einer chirurgischen Schere einen 1,5 bis 2 Zentimeter langen Schnitt in Richtung Brust.
Um die untere Halsvene freizulegen, verwenden Sie eine Irisschere, um die dünne Gewebeabdeckung stumpf zu sezieren. Das proximale cephalische Ende der Vena jugularis external besteht aus zwei Ästen, die visuell identifiziert werden können. Heben Sie die Vena jugularis zusammen mit ihrem Bindemembrangewebe an, um die Lymphdrüse zu visualisieren, die an der Vena jugularis befestigt ist.
Trennen Sie die Vene vorsichtig entlang der Gefäßrichtung vom umgebenden Muskel, Fett und anderen Geweben. Stoßen Sie die Pinzette unter die Vena jugularis, ohne die Kollateralblutgefäße zu beschädigen, und führen Sie zwei Stücke 6-0-Naht unter die Vene, um die beiden Enden des Blutgefäßes einzeln zu markieren. Ziehen Sie ein Stück der Naht so weit wie möglich in Richtung Rattenkopf und ligiieren Sie die Vene mit zwei bis drei Knoten mit einer Pinzette kranial.
Legen Sie die zweite Ligatur mit einem losen Knoten auf das kaudale Ende der Vene. Befestigen Sie einen 11 Zentimeter langen Polyurethan- oder PU-Katheter an der vorbereiteten stumpfen Spitzenspritze, die mit der heparinisierten Kochsalzlösung gefüllt ist, und drücken Sie die heparinisierte Kochsalzlösung langsam in den Katheter, um Luftblasen zu vermeiden. Stoßen Sie die flache Seite der Pinzette ohne Spitze unter die Vena jugularis an, um auf der anderen Seite auszutreten.
Machen Sie einen kleinen V-förmigen Schnitt auf der Vene in der Nähe der Schädelbindung mit einer Castroviejo-Mikroschere und öffnen Sie den Schnitt vorsichtig mit der Spitze der Ellenbogengefäß-Dilatatorzange. Schneiden Sie die schräge Öffnung des vorderen Endes des Halsvenenkatheters aus. Bepflanzen Sie das schräge Ende des Rohres mit einer Pinzette und schieben Sie es in die Halsvene.
Während Sie den Katheter vorschieben, ziehen Sie langsam die mikrochirurgische Zange des Ellbogens zurück und klemmen Sie die äußere Oberfläche des Gefäßes mit einer Pinzette ein. Beenden Sie das Einsetzen des Katheters, wenn Sie die erste blaue Markierung des PU-Röhrchens treffen, das etwa drei Zentimeter lang ist. Befestigen Sie den eingeführten Katheter mit einer Pinzette sowohl mit kaudalen als auch mit rostralen Ligaturen an der Vene.
Fädeln Sie eine 6-0-Naht mit einer Nahtnadel durch das freiliegende Gewebe auf der rechten Seite des Einschnitts und binden Sie die Ligatur mit einem Hämostaten. Biegen Sie dann den Katheter an der zweiten blauen Markierung, um sich mit der gleichen Ligatur zu verbinden und den PU-Schlauch nicht zu verschließen. Nachdem Sie den gesamten zusätzlichen Nahtfaden abgeschnitten haben, schließen Sie den Katheter, indem Sie die stumpfe Spritze mit Spitze durch einen 22-Gauge-Edelstahlstopfen ersetzen.
Legen Sie die Ratte in die Rückenposition und reinigen Sie den Bereich zwischen dem Schulterblatt vorsichtig mit dem Wattebausch, der mit 75% medizinischem Alkohol getränkt ist. Machen Sie mit der chirurgischen Schere einen sehr kleinen Schnitt in der Mitte des Rückenhalses. Durch den dorsalen Schnitt führen und drücken Sie den Trochar unter der Haut sanft in Richtung des ventralen Schnitts auf der rechten Seite des Halses.
Setzen Sie den Venenkatheter in den Trochar und ziehen Sie ihn dann heraus und führen Sie den Venenkatheter zum dorsalen Schnitt. Nachdem Sie den äußeren Katheter in der Muskelschicht gesichert haben, schließen Sie die Hautschicht der ventralen und dorsalen Schnitte mit der 6-0 Nylonnaht- und Nahtnadel und tupfen Sie alle chirurgischen Schnitte mit Iodophor ab. Entfernen Sie als Nächstes den Katheterstopfen, indem Sie den Katheter mit den Fingerspitzen umklammern.
Platzieren Sie eine neue stumpfe Spitzenspritze und ziehen Sie die Spritze langsam zurück, um den Blutfluss zu testen. Halten Sie den Katheter erneut mit den Fingerspitzen fest. Injizieren Sie 0,2 Milliliter heparinisierte Kochsalzlösung und 0,1 Milliliter Verschlusslösung mit der stumpfen Spitzenspritze in den Katheter und ersetzen Sie dann die Spritze durch einen Edelstahlstecker.
Lösen Sie den Katheter und drücken Sie den Stecker leicht ein, um die Dichtigkeit des Katheters zu gewährleisten. Um Blutproben für hämatologische Tests zu sammeln, legen Sie die Ratte in ein Rückhaltesystem, öffnen Sie den Plug und führen Sie die Spritze in den venösen PU-Katheter ein, um sicherzustellen, dass der Katheter nicht verstopft wird. Entsorgen Sie das ursprünglich entnommene Blut, das eine Mischung aus Blut, geretteter Kochsalzlösung und Katheterverschlusslösung enthält.
Sammeln Sie mit einer neuen Spritze 150 Mikroliter frische Blutprobe und übertragen Sie die Blutprobe in ein 0,5-Milliliter-Röhrchen, das zuvor mit K2EDTA besprüht wurde. Injizieren Sie 150 Mikroliter vorgewärmte normale Kochsalzlösung und infundieren Sie 0,2 Milliliter sterile heparinisierte normale Kochsalzlösung durch den Katheter. Injizieren Sie 100 Mikroliter der Verschlusslösung in den Katheter, um die Versiegelung und Sterilität des Katheters vor der nächsten Probenentnahme sicherzustellen.
In der aktuellen Studie wurden die physiologischen und hämatologischen Zustände über sechs Tage postoperativ untersucht. Die Mehrheit der Ratten erholte sich innerhalb von vier bis sechs Tagen nach der Operation, was durch eine Körpergewichtszunahme von mehr als 10 Gramm, regelmäßige Nahrungsaufnahme, ausgewählte Blutbestandteile im Zusammenhang mit Infektionen, Dehydrierung und Entzündungen, einschließlich weißer Blutkörperchen, roter Blutkörperchen, Hämoglobin und Thrombozytenzahl, belegt wurde. So benötigten die Ratten nach dem Eingriff mindestens vier bis sechs Tage für die Genesung.
Die große Wasseraufnahme deutete auf eine Austrocknung am ersten Tag nach der Operation hin. Darüber hinaus wurde die Pharmakokinetik des natürlichen Polyphenols Ellagsäure im etablierten Jugularvenen-Kanülierungsrattenmodell untersucht und die schlechte Bioverfügbarkeit der Ellagsäure durch ihre niedrige Plasmakonzentration über 24 Stunden angezeigt. Die korrekte Isolierung der Vena jugularis ist der wichtigste erste Schritt, da die in andere Weichteile eingebettete Jugularvene für den Forscher möglicherweise nicht sofort sichtbar ist.
Sequenzielle Blutentnahmen innerhalb desselben Tieres können im etablierten JVC-Rattenmodell durchgeführt werden. Es ist ein nützliches und robustes Werkzeug, um die Leistung von Arzneimittelformulierungen in vivo zu bewerten.
