小型実験動物からの反復採血は、医薬品リード最適化の重要な側面です。このプロトコルは、永久的な頸静脈カニューレーションラットモデルを確立するための顕微手術スキルを詳述する。この技術は、頸静脈カニューレラットモデルを効率的に確立し、ストレスや痛みを避けながら、意識のあるラットのカニューレを通して血液サンプルを繰り返し収集することができる。
頸静脈とそのカニューレの位置を特定することは、解剖学的複雑さの視覚的なデモンストレーションがこのモデルでは利用できないため重要です。まず、75%の医療用アルコールで無菌ワークステーションを準備し、剃毛したラットを酸素と混合したイソフルランで麻酔します。メロキシカム溶液を1キログラムあたり2ミリグラムの用量で皮下注射し、鉗子で首の正中線の右側の鎖骨付近の皮膚を慎重に持ち上げ、一対の外科用はさみを使用して、胸に向かって長さ1.5〜2センチメートルの切開を行う。
頸静脈の下を露出させるには、虹彩はさみを使用して薄い組織カバーを鈍く解剖します。外頸静脈の近位頭蓋端は、視覚的に識別できる2つの枝からなる。頸静脈とその結合膜組織を持ち上げて、頸静脈に付着したリンパ腺を可視化します。
血管方向に沿って静脈を周囲の筋肉、脂肪、および他の組織から慎重に分離する。側副血管を損傷することなく頸静脈の下に鉗子をナッジし、血管の両端を個別にマークするために静脈の下に2つの6-0縫合糸を通す。縫合糸の1枚をラットの頭部に向かってできるだけ遠くに引っ張り、鉗子を使用して2〜3ノットで静脈を頭蓋に結紮する。
2番目の合字を1つの緩い結び目で静脈の尾端に置きます。ヘパリン化生理食塩水で満たされた準備された鈍い先端シリンジに11センチメートルのポリウレタンまたはPUカテーテルを取り付け、気泡を避けるためにヘパリン化生理食塩水をゆっくりとカテーテルに押し込む。鉗子の非先端平らな側を頸静脈の下に引っ張って、反対側に出ます。
一対のカストロビエホマイクロハサミで頭蓋結びの近くの静脈に小さなV字型の切り傷を作り、肘血管拡張鉗子の先端で切開部を静かに開いた。頸静脈カテーテルの前端の斜め開口部を切り出す。チューブの斜めの端を鉗子で植え、頸静脈にスライドさせます。
カテーテルを前進させながら、肘の顕微手術用鉗子をゆっくりと引き抜き、血管の外表面を鉗子でクランプする。長さ約3センチのPUチューブの最初の青いマークに当たったら、カテーテルの挿入を停止します。挿入したカテーテルを鉗子を用いて尾側と吻側の両方の結紮で静脈に固定する。
縫合針を用いて切開部の右側の露出組織に6−0の縫合糸を通し、結紮を止血剤で結んだ。次に、2番目の青いマークでカテーテルを曲げて同じ合字で結合し、PUチューブを閉塞させないようにします。余分な縫合糸をすべて切り取った後、鈍い先端のシリンジを22ゲージのステンレススチールプラグに交換してカテーテルを閉じます。
ラットを背側の位置に置き、綿球を75%の医療用アルコールに浸して肩甲骨の間の領域を優しくきれいにする。外科用はさみを使用して、背頸部の中心に非常に小さな切開を行います。背側切開部を通して、皮膚の下のトロチャーを首の右側の腹側切開部に向かって導き、優しく押し込む。
静脈カテーテルをトロチャーに入れ、静脈カテーテルを引き出し、背部切開部に導く。外装カテーテルを筋肉層に固定した後、腹側および背部切開部の皮膚層を6-0ナイロン縫合糸および縫合針で閉じ、すべての外科的切開部をヨードフォールで拭き取る。次はカテーテルを指先で握り締めてカテーテルプラグを外します。
新しい鈍い先端シリンジを置き、ゆっくりとシリンジを引き戻して血流をテストします。カテーテルを再び指先で持ちます。鈍い先端シリンジを使用して0.2ミリリットルのヘパリン処理生理食塩水および0.1ミリリットルのロック溶液をカテーテルに注入し、シリンジをステンレス製のプラグと交換する。
カテーテルのクランプを外し、プラグをわずかに押し込んでカテーテルの気密性を確保します。血液学的検査のために血液サンプルを採取するには、ラットを拘束具に入れ、プラグを開き、シリンジを静脈PUカテーテルに挿入して、カテーテルが妨げられていないことを確認します。血液、ヘパリン化生理食塩水、およびカテーテルロック溶液の混合物を含む最初に抜き出された血液を捨てる。
新しい注射器を使用して、150マイクロリットルの新鮮な血液サンプルを収集し、以前にK2EDTAを噴霧した0.5ミリリットルのチューブに血液サンプルを移す。予め加温した正常生理食塩水150マイクロリットルを注入し、0.2ミリリットルの滅菌ヘパリン化正常生理食塩水をカテーテルを通して注入する。100マイクロリットルのロック溶液をカテーテルに注入し、次のサンプル採取前にカテーテルの密封性と無菌性を確保します。
現在の研究では、術後6日間にわたる生理学的および血液学的状態を調査した。ラットの大部分は、10グラム以上の体重増加、定期的な食物摂取、感染、脱水、および炎症に関連する選択された血液成分(白血球、赤血球、ヘモグロビン、および血小板数を含む)によって証明されるように、手術後4〜6日以内に回復した。したがって、ラットは、処置後の回復のために最低4〜6日を必要とした。
水分の摂取量が多いため、術後1日目に脱水症状がみられた。さらに、天然ポリフェノールエラグ酸の薬物動態を確立された頸静脈カニューレーションラットモデルで研究し、エラグ酸の生物学的利用能の悪さは、24時間にわたる血漿濃度が低いことによって示された。他の軟部組織に埋め込まれた頸静脈は研究者にすぐには見えない可能性があるため、頸静脈の正しい単離は最も重要な第一歩です。
同じ動物内での逐次採血は、確立されたJVCラットモデルにおいて行うことができる。これは、インビボで薬物製剤の性能を評価するための有用で堅牢なツールです。
