A amostragem repetida de sangue do pequeno animal de laboratório é um aspecto importante da otimização do chumbo farmacêutico. Este protocolo detalha as habilidades microcirúrgicas para estabelecer um modelo permanente de rato de cannulação venosa jugular. Esta técnica pode estabelecer eficientemente um modelo de rato de canulação venosa jugular e coletar repetidamente amostras de sangue através da cânula em ratos conscientes, evitando estresse e dor.
É importante localizar a veia jugular e sua canulação, pois a demonstração visual da complexidade anatômica não está disponível para este modelo. Para começar, prepare a estação de trabalho asséptica com 75% de álcool médico, depois anestesiar o rato raspado com isoflurane misturado com oxigênio. Subcutâneamente injete solução de meloxicam a uma dose de dois miligramas por quilograma, em seguida, levante cuidadosamente a pele perto da clavícula no lado direito da linha média do pescoço com fórceps, e usando um par de tesouras cirúrgicas, faça uma incisão de 1,5 a 2 centímetros de comprimento em direção ao peito.
Para expor a veia jugular inferior, use a tesoura de íris para dissecar a fina tampa do tecido. A extremidade cefálica proximal da veia jugular externa consiste em dois ramos que podem ser identificados visualmente. Levante a veia jugular junto com seu tecido membrana conjuntivo para visualizar a glândula linfática presa à veia jugular.
Separe cuidadosamente a veia ao longo da direção vascular do músculo circundante, gordura e outros tecidos. Cutuca os fórceps sob a veia jugular sem danificar os vasos sanguíneos colaterais e passar dois pedaços de sutura 6-0 sob a veia para marcar as duas extremidades do vaso sanguíneo individualmente. Puxe um pedaço da sutura o mais longe possível em direção à cabeça do rato e liga a veia cranialmente com dois a três nós usando fórceps.
Coloque a segunda ligadura na extremidade caudal da veia com um nó solto. Conecte um poliuretano de 11 centímetros, ou PU, cateter à seringa de ponta cega preparada preenchida com o soro fisiológico heparinizado, e empurre lentamente o soro fisiológico heparinizado para dentro do cateter para evitar bolhas de ar. Cutuque o lado plano não-ponta dos fórceps sob a veia jugular para sair do outro lado.
Faça um pequeno corte em forma de V na veia perto da gravata craniana com um par de microscisores castroviejo, e gentilmente abriu a incisão com a ponta dos fórceps dilatadores do vaso do cotovelo. Corte a abertura oblíqua da parte frontal do cateter vesculato jugular. Plante a extremidade oblíqua do tubo com fórceps e deslize-a para a veia jugular.
Ao avançar no cateter, retire lentamente os fórceps microcirúrgicos do cotovelo e fixe a superfície externa do vaso com fórceps. Pare de inserir o cateter ao atingir a primeira marca azul do tubo PU, que tem aproximadamente três centímetros de comprimento. Fixar o cateter inserido na veia com ligaduras caudais e rostrais usando fórceps.
Enfie uma sutura 6-0 através do tecido exposto no lado direito da incisão usando uma agulha de sutura, e amarre a ligadura com um hemostata. Em seguida, dobre o cateter na segunda marca azul para se ligar com a mesma ligadura e evitar ocluer a tubulação pu. Depois de cortar toda a rosca de sutura extra, feche o cateter substituindo a seringa com ponta atada por um plugue de aço inoxidável calibre 22.
Coloque o rato na posição dorsal e limpe suavemente a área entre a escápula com a bola de algodão encharcada em 75% de álcool médico. Usando a tesoura cirúrgica, faça uma incisão muito pequena no centro do pescoço dorsal. Através da incisão dorsal, guie e empurre suavemente o trochar sob a pele em direção à incisão ventral no lado direito do pescoço.
Coloque o cateter venoso no trochar e, em seguida, puxe para fora e guie o cateter venoso em direção à incisão dorsal. Depois de fixar o cateter exteriorizado na camada muscular, feche a camada de pele das incisões ventral e dorsal com a sutura de nylon 6-0 e agulha de sutura e cotonete todas as incisões cirúrgicas com iodophor. Em seguida, remova o plugue do cateter apertando o cateter com as pontas dos dedos.
Coloque uma nova seringa de ponta contundente e puxe lentamente a seringa para testar o fluxo sanguíneo. Segure o cateter novamente com as pontas dos dedos. Injete 0,2 mililitros de soro fisiológico heparinizado e 0,1 mililitros de solução de bloqueio no cateter usando a seringa de ponta cega e, em seguida, substitua a seringa por um plugue de aço inoxidável.
Despreste o cateter e empurre o plugue ligeiramente para garantir o aperto do cateter. Para coletar amostras de sangue para testes hematológicos, coloque o rato em um contidor, abra o plugue e insira a seringa no cateter pu venoso para garantir que o cateter não esteja obstruído. Descarte o sangue inicialmente retirado contendo uma mistura de sangue, soro fisiológico heparinizado e solução de bloqueio de cateter.
Usando uma nova seringa, colete 150 microliters de amostra de sangue fresco e transfira a amostra de sangue para um tubo de 0,5 mililitro previamente pulverizado com K2EDTA. Injete 150 microlitres de soro fisiológico normal pré-aquecido, e infundir 0,2 mililitros de soro fisiológico normal heparinizado estéril através do cateter. Injete 100 microliters da solução de bloqueio no cateter para garantir a vedação e a esterilidade do cateter antes da próxima coleta de amostras.
No presente estudo, foram investigadas as condições fisiológicas e hematológicas ao longo de seis dias de pós-operatório. A maioria dos ratos se recuperou dentro de quatro a seis dias após a cirurgia, como evidenciado pelo ganho de peso corporal de mais de 10 gramas, ingestão regular de alimentos, componentes sanguíneos selecionados relacionados à infecção, desidratação e inflamação, incluindo glóbulos brancos, glóbulos vermelhos, hemoglobina e contagem de plaquetas. Assim, os ratos exigiram um mínimo de quatro a seis dias para recuperação após o procedimento.
A grande ingestão de água indicou desidratação no primeiro dia pós-operação. Além disso, a farmacocinética do ácido ellagicolítico polifenol natural foi estudada no modelo de rato de cannulação vesícula jugular estabelecido e a má biodisponibilidade do ácido ellagiágico foi indicada por sua baixa concentração plasmática ao longo de 24 horas. O isolamento correto da veia jugular é o primeiro passo mais importante porque a veia jugular embutida em outros tecidos moles pode não ser imediatamente visível para o pesquisador.
A amostragem de sangue sequencial dentro do mesmo animal pode ser realizada no modelo de rato JVC estabelecido. É uma ferramenta útil e robusta para avaliar o desempenho das formulações de medicamentos in vivo.
