Wir haben eine neue Methode entwickelt, bei der wir einen XF-Analysator für Seepferdchen verwenden, um den Sauerstoffverbrauch direkt zu messen. Aber gemeinsamer Proxy für die mitochondriale Funktion in akutem Objektträgerschnitt von erwachsenen Mäusen. Diese Methode misst eine Zelle durch Energetik in Punktionen von anatomisch definierten Gehirnstrukturen.
Die Verwendung akuter Scheiben ahmt die physiologische zelluläre Umgebung genauer nach, was nicht auf die Weise erreicht werden kann, wie mitochondriale oder Kulturzellen isoliert werden. Diese Methode wird für Forscher, die auf dem Gebiet der Parkinson-Krankheit und der Huntington-Krankheit arbeiten, von großem Interesse sein. Öffnen Sie zunächst das extrazelluläre Flussmittel-Assay-Kit und entfernen Sie sowohl die Sensorkassette als auch die Utility-Platte.
Legen Sie dann die Sensorkassette beiseite und berühren Sie die Sensoren nicht. Als nächstes fügen Sie 600 Mikroliter kalibrierte Lösung zu jeder Wand der Versorgungsplatte hinzu. Legen Sie die Sensorkassette auf die Gebrauchsplatte und tauchen Sie die Sensoren in die Kalibrierlösung, um sicherzustellen, dass die dreieckige Kerbe der Versorgungs- und Sensorpatronenplatte korrekt ausgerichtet ist.
Verschließen Sie anschließend das extrazelluläre Flussmittel-Assay-Kit mit Dichtungsfolie, um eine Verdunstung der kalibrierten Lösung zu verhindern, und legen Sie es dann über Nacht in einen 37 Grad Celsius-Inkubator, der nicht mit Kohlendioxid oder Sauerstoff ergänzt wurde. Öffnen Sie die Ösenfänger-Mikroplatte und nehmen Sie die Ösenplatte für das Gewebesitzen heraus. Erwärmen Sie dann ein geeignetes Volumen des voroxygenierten modifizierten künstlichen Rückenmarksflüssigkeitspuffers in einem 50-Milliliter-Schlauch auf 37 Grad Celsius.
Als nächstes fügen Sie BSA zu einer Endkonzentration von vier Milligramm pro Milliliter hinzu, um den Atempuffer vorzubereiten. Fügen Sie 625 Mikroliter Atempuffer vorsichtig zu jedem Vertiefungsraum der Ösenplatte hinzu, während Sie ein Schütteln der Platte vermeiden, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen im Puffer jedes Brunnens vorhanden sind. Sezieren Sie das Gehirn sofort in 10 Milliliter eiskalter voroxygenierter Schneidlösung.
Dann mit einem Vibratomabschnitt koronale Striatalscheiben, nach den Anweisungen des Herstellers bei einer Dicke von 150 Mikrometer in eiskalter voroxygenierter Schneidlösung. Als nächstes gewinnen Sie die Scheiben in 50 Millilitern sauerstoffhaltiger künstlicher Gehirnrückenmarksflüssigkeit zurück. Und bewahren Sie sie bis zu 30 Minuten bei Raumtemperatur in Lösung auf.
Nach der Gewinnung die Scheiben in eine 35 x 10 Millimeter große Petrischale mit fünf Millimetern Atempuffer geben. Mit einem Edelstahl-Biopsiestempel erzeugen Sie ein kreisförmiges Stück Gewebe im gewünschten Bereich des geschnittenen Gehirns, indem Sie den Stempel vorsichtig nach unten drücken, während Sie die Scheibe im Puffer halten. Entfernen Sie dann den Rest des Gewebes, heben Sie den Schlag weg und entfernen Sie das kreisförmige Stück Gewebe in den Puffer.
Als nächstes schneiden Sie das Ende einer Pipettenspitze von einem Milliliter ab, um ein Loch mit einem Durchmesser von einem Punkt fünf bis zwei Punkt null Millimeter zu machen, und verwenden Sie es, um die gestanzte Scheibe zu halten und an die Oberseite des Aufnahmebildschirms zu übertragen. Saugen Sie ein Stück gestanztes Hirngewebe ab und legen Sie das Gewebe vorsichtig auf die Netzseite des Aufnahmebildschirms, ein kreisförmiges Stück Kunststoff, an dem das Netz an einer Seite befestigt ist. Trocknen Sie den Fangschirm mit einem Papiertaschentuch vorsichtig ab und entfernen Sie die Feuchtigkeit, wodurch das Gewebe klebrig wird und an der Mitte des Netzes befestigt wird.
Als nächstes halten Sie die Capture-Screen-Scheibe mit einer Pinzette nach unten und legen Sie sie in eine der Vertiefungen der Inkubationsösenplatte. Inkubieren Sie dann die Ösenplatte bei 37 Grad Celsius in einem Inkubator für mindestens 30 Minuten, um ein Gleichgewicht zwischen Temperatur und pH-Wert zu ermöglichen, bevor Sie den Assay durchführen. Verdünnen Sie die gewünschten Verbindungen und modifizierten künstlichen zerebralen Rückenmarksflüssigkeiten ohne BSA auf die endgültige Stammkonzentration der Arbeitskonzentration für die Ports A bzw. D.
Ziehen Sie 75 Mikroliter der verdünnten Verbindungen vorsichtig in die entsprechenden Einspritzanschlüsse der Sensorkartusche vor, indem Sie die Spitzen in einem Winkel von 45 Grad zur Hälfte in die Einspritzöffnungen mit der Spitze an der Wand des Einspritzanschlusses platzieren, da ein vollständiges Einsetzen zu einem Auslaufen von Verbindungen durch den Anschluss führen kann. Ziehen Sie anschließend die Spitzen vorsichtig aus den Anschlüssen heraus, ohne Luftblasen zu erzeugen, und tippen Sie nicht auf einen Teil der Patrone, um Luftblasen nicht zu lindern. Überprüfen Sie dann visuell die Einspritzöffnungen auf gleichmäßiges Laden, um sicherzustellen, dass sich die gesamte Flüssigkeit im Anschluss befindet und keine Resttropfen auf der Oberseite der Patrone vorhanden sind.
Nachdem Sie die Sensorpatrone auf die Gebrauchsplatte gelegt haben, legen Sie sie für 30 Minuten in einen Inkubator, damit sie sich bei vorsichtiger Handhabung auf 37 Grad Celsius erwärmen kann, indem Sie sie nur auf der Gebrauchsplatte festhalten und so wenig wie möglich bewegen. Laden Sie zuerst die Assay-Vorlage in die Software und drücken Sie dann den grünen Startknopf. Legen Sie dann die Sensorpatrone auf der Gebrauchsplatte in das Instrumentenfach ein, stellen Sie sicher, dass die Platte korrekt sitzt und flach ist, und laden Sie die mit Medikamenten gefüllte Sensorpatrone zur Kalibrierung in den Analysator.
Folgen Sie anschließend den Anweisungen auf dem Bildschirm, um die Kalibrierung durchzuführen. Und die Sensoren ausgleichen. Sobald der Balanceschritt abgeschlossen ist, entfernen Sie die Kalibrierplatte und ersetzen Sie sie durch die Ösenplatte, die das Netz und die Gewebescheiben enthält.
Messen Sie dann die Sauerstoffverbrauchsrate in jeder Vertiefung der Platte unter Verwendung der Assay-Protokolle, wie im Manuskript beschrieben. Anschließend analysieren Sie die Messdaten der Sauerstoffverbrauchsrate und die Daten zum Kopplungswirkungsgrad. Die Sauerstoffverbrauchsraten für verschiedene Dicken und Stanzgrößen von Scheiben in der Kontrollgruppe zeigten eine stabile Basalatmung über die gesamte Messung und waren proportional zum Volumen der Scheibe.
Darüber hinaus waren die Sauerstoffverbrauchsraten für fünf Stunden relativ stabil mit weniger als 10% Abbau. Der mitochondriale Kopplungswirkungsgrad wurde verglichen und die Scheibe bei der Dicke von 150 Mikrometern und einer Stanzgröße von 1,5 Millimetern zeigte die höchste Kopplungseffizienz. Die Sauerstoffverbrauchsraten wurden für junge und alte Gruppen von Pink1-Knockout und ihre altersangepassten Wildtyp-Mäuse gemessen.
Die basale Sauerstoffverbrauchsrate war sowohl in der Knockout- als auch in der Wildtyp-Gruppe für junge Mäuse ähnlich. Es nahm jedoch für die Knockout-Mäuse in der alten Gruppe ab. Die mitochondriale Dysfunktion bei den Knockout-Mäusen wurde jedoch für die junge Altersgruppe beobachtet, was auf die verminderte Kopplungseffizienz durch den Knockout von Pink1 hindeutet.
Zu den kritischen Schritten in diesem Protokoll gehören die Vorbereitung von Gehirnschnitten, die Übertragung auf die Oberseite des Erfassungsbildschirms, das Platzieren von Objektträgern in Vertiefungen und das Aufbewahren am Erfassungsbildschirm während der Messungen.
