Cryo-EM hat sich zu einer Standardtechnik zur Strukturbestimmung von Proteinen und deren Komplexen entwickelt. Dieses Protokoll beschreibt die Best Practices zum Abrufen hochauflösender Cryo-EM-Datensätze aus den mittleren 200-kV-TEM-Mikroskopen. Kryo-EM kann die Proteinstruktur unter nativen Bedingungen in Lösung für mehrere Konformationszustände und funktionelle Zustände gleichzeitig bestimmen, was für andere Strukturtechniken schwer fassbar ist.
Die gewonnenen Strukturinformationen können zur Aufklärung molekularer Mechanismen der Proteinfunktion sowie für das strukturbasierte Wirkstoffdesign verwendet werden. Zum Beispiel zeigte eine kürzlich erschienene Veröffentlichung in der Struktur von Amyloidfibrillen mehrere Bindungsstellen eines lebenswichtigen Liganden. In diesem Protokoll verwenden wir jedoch die Standardproben von Apoferritin und Proteasom, um die kritischen Schritte bei der Gewinnung hochauflösender Kryo-EM-Daten zu demonstrieren.
Die Bedienung eines Cryo-TEM ist in den letzten Jahren einfacher geworden, insbesondere durch die Einführung fortschrittlicher Automatisierungsfunktionen. Für die erste Sitzung empfehlen wir Ihnen jedoch, eine Schulung mit erfahreneren Benutzern durchzuführen. Von dort aus ist der Fortschritt in der Technik relativ schnell.
Das Verfahren wird von Adrian Koh, Senior Application Scientist bei Thermo Fisher Scientific, demonstriert. Setzen Sie automatische Gitter unter flüssigen Stickstoffbedingungen in die Kassette des automatischen Ladegeräts ein. Setzen Sie die Kassette mit automatischen Gittern in eine mit flüssigem Stickstoff gekühlte Transferkapsel ein.
Führen Sie die Kapsel weiter in das Mikroskop ein und klicken Sie auf die Dock-Schaltfläche in der Mikroskop-Benutzeroberfläche, um die Kassette aus der Kapsel in den automatischen Lader des Mikroskops zu laden. Klicken Sie auf die Schaltfläche Inventar, um das Vorhandensein von automatischen Rastern in der geladenen Kassette zu überprüfen. Klicken Sie dann auf die Schaltflächen Laden und Entladen, um die automatischen Raster in die Spalte für TEM-Imaging einzufügen.
Wählen Sie die Registerkarte Atlas und klicken Sie auf die Schaltfläche Neue Sitzung, um eine neue Sitzung zu öffnen. Geben Sie Details wie Sitzungsname und Datenspeicherort ein und klicken Sie auf die Schaltfläche Übernehmen. Wählen Sie die gewünschten Raster aus, indem Sie ein Kontrollkästchen neben der entsprechenden Rasternummer aktivieren.
Klicken Sie auf die Schaltfläche Start, um eine vollautomatische Sammlung von Atlanten aller ausgewählten Raster zu starten. Wenn die Sammlung abgeschlossen ist, klicken Sie auf Rasterbeschriftungen, um die erworbenen Atlanten zu überprüfen. Wählen Sie die Registerkarte EPU und gehen Sie zu Neue Sitzung, um eine neue Sitzung im linken Bereich zu erstellen.
Wählen Sie die Option Neue Sitzung, um die aktuell eingestellten optischen Voreinstellungen zu verwenden. Geben Sie den Sitzungsnamen ein. Wählen Sie den manuellen Typ der Sitzung aus, um die Kontrolle über die Auswahl der einzelnen Bohrungen und Rasterquadrate zu haben, die für die Datenerfassung später im Protokoll ausgewählt wurden.
Wählen Sie den schnelleren Aufnahmemodus, um aberrationsfreie Bildverschiebung für die Datenerfassung zu verwenden. Geben Sie dann den Speicherort für die Metadaten ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche Übernehmen, um eine neue Sitzung zu erstellen.
Wählen Sie die quadratische Auswahlaufgabe im linken Bereich aus, um den gesammelten Atlas des Rasters anzuzeigen. Identifizieren Sie die Gitterquadrate mit intakter Stützfolie ohne Beschädigung, dünnem Glaseis und Folienlöchern, vernachlässigbarer kristalliner Eiskontamination im Gitterquadrat und minimalem Helligkeitsgradienten über das Gitterquadrat und innerhalb einzelner Folienlöcher. Wählen Sie die Rasterquadrate für die Datenerfassung aus, entweder im vollständigen Atlas oder in hochwertigen Kachelbildern.
Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf ein Rasterquadrat von Interesse und wählen Sie die gesamte Auswahlaufgabe aus. Klicken Sie auf die Schaltfläche Auto Eucentric, um automatisch zum ersten ausgewählten Rasterquadrat zu wechseln. Passen Sie die euzentrische Höhe an und erfassen Sie ein quadratisches Gitterbild, um Folienlöcher zu finden.
Klicken Sie auf die Schaltfläche Bohrungen suchen, um Folienlöcher im Bild zu finden. Klicken Sie auf die Schaltfläche Bohrungen entfernen, um die Schaltfläche Rasterleiste zu schließen, um die Auswahl von Bohrungen in der Nähe von Rasterbalken aufzuheben. Passen Sie die Grenzen im Helligkeitshistogramm des Eisfilters an, um alle Löcher mit zu dickem Eis und alle leeren Löcher zu entfernen.
Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf ein Loch im quadratischen Rasterbild und wählen Sie Bühne zu Position verschieben Bühne verschieben hier. Wählen Sie im linken Bereich die Vorlagendefinitionsaufgabe aus. Klicken Sie auf die Schaltfläche Erwerben, um ein ganzes Bild zu erhalten.
Legen Sie die Werte für die Verzögerung nach der Bildverschiebung auf 0,5 Sekunden und die Verzögerung nach der Bühnenverschiebung auf fünf Sekunden fest. Klicken Sie auf die Schaltfläche Bohrung suchen und zentrieren, um eine Bohrung im Bild zu zentrieren. Wählen Sie die Schaltfläche Aufnahmebereich hinzufügen und klicken Sie auf das Bild, um die Position im mittleren Loch auszuwählen, an der die Bildaufnahme mit hoher Vergrößerung durchgeführt wird.
Wählen Sie die Schaltfläche Autofokusbereich hinzufügen und klicken Sie auf das Bild, um die Position auf der Stützfolie neben der zentrierten Bohrung auszuwählen, an der der automatische Bildfokus durchgeführt wird. Klicken Sie auf den grünen Erfassungsbereich, um eine Abfolge von Defokussierungswerten in der Defokussierungsliste im oberen Bereich des Softwarefensters festzulegen. Nachdem Sie die Autofokus-spezifischen Einstellungen festgelegt haben, wählen Sie die Option Nach der Zentrierung zum Autofokus am Start jedes AFIS-Clusters.
Wählen Sie die Option Objektiv für schnellere Autofokussierung und reduzierte Bühnendrift. Klicken Sie in der Bohrungsauswahlaufgabe auf die Schaltfläche Alle Quadrate vorbereiten, um die Datenerfassung und alle anderen ausgewählten Gitterquadrate automatisch entsprechend den verwendeten Einstellungen in diesem ersten Rasterquadrat einzustellen. Wählen Sie die Vorlagendefinitionsaufgabe aus, erfassen Sie ein neues Bild, verschieben Sie die Bühne per Rechtsklick in einen sauberen Bereich auf Kohlefolie und wählen Sie hier den Menüpunkt Bühne verschieben.
Wählen Sie die Registerkarte Automatische Funktionen aus. Nachdem Sie den gewünschten Defokus und die Iteration eingestellt haben, wechseln Sie zum Autofokus-Preset und klicken Sie auf den Start-Button, um die Autofokus-Funktion auszuführen. Wählen Sie die Autostigmate-Aufgabe aus, wechseln Sie zur Voreinstellung Thon Ring und drücken Sie die Starttaste.
Wählen Sie den Autokoma-Task aus und drücken Sie die Start-Taste. Verschieben der Bühne in einen Bereich mit einem unterbrochenen Gitterquadrat Bestätigen Sie die Transparenz des Bereichs, indem Sie ein einzelnes Autofokusbild aufnehmen.
Öffnen Sie die Sherpa-Benutzeroberfläche und wählen Sie die Energiefilteranwendung aus. Klicken Sie auf die Schaltfläche Center und die Null-Verlust-Option, um den Null-Verlust-Energiefilter-Schlitz zu zentrieren. Klicken Sie auf die Schaltfläche Tune in der Option Isochromatizität.
Klicken Sie auf die Option Tune Magnification und Tune Distortions in den geometrischen und chromatischen Verzerrungen. Gehen Sie zur Registerkarte EPU, wählen Sie den Task Automatisierte Erfassung aus und klicken Sie auf die Schaltfläche Start Run, um mit der vollautomatischen Datenerfassung zu beginnen. Die Abbildung zeigt Kryo-EM-Gitter, die einen Gradienten der Eisdicke über der Gitteroberfläche anzeigen.
Die von der weiteren Untersuchung ausgeschlossenen Gitter sind schlechtes Gitter mit dickem Eis und ein gebogenes Gitter mit schlechtem Eis und Verschmutzung, während akzeptable Gitter solche mit gutem Eisgradienten und ein typisches Gitter mit gutem dünnem Eis und kleinem Eisgradienten sind. Die Abbildung zeigt das endgültige 3D-Rendering der rekonstruierten Apoferritin-Kryo-EM-Karte. Die hohe Stabilität und Symmetrie machen es zu einem optimalen Benchmark-Sample für hochauflösende Cryo-EM-Bildgebung und Bildverarbeitung.
Bayes'sches Polieren, CTF-Verfeinerung und Ewald-Kugelkorrektur führten zu einer Angström-Auflösungskarte von 1,63. Die Abbildung zeigt eine detaillierte Ansicht der rekonstruierten Apoferritin-Kryo-EM-Karte auf der Ebene der einzelnen Aminosäure-Seitenketten. Die Dichte der Aminosäure-Seitenketten ist gut aufgelöst und das Atommodell kann eindeutig innerhalb der Karte aufgebaut werden.
Das Bild hier zeigt zwei verschiedene Datensätze mit unterschiedlichen Defokussierungswerten, die aus demselben Kryo-EM-Gitter mit ähnlichen Gitterquadraten mit einem vollständig geöffneten Spalt und einem 10-Elektronenvolt-Spalt gesammelt wurden, was darauf hinweist, dass der 10-Elektronenvolt-Spalt den Bildkontrast signifikant verbessert. Die Abbildung hierin zeigt eine Übersicht über die 20S Proteasom Cryo-EM Karte mit segmentierten Untereinheiten, die als Standard-Cryo-EM-Probe verwendet werden. Und seine vergrößerte Ansicht mit einem angepassten Atommodell stellt den stabilen katalytischen Kern des Proteasom-Komplexes mit der D7-Symmetrie dar.
Das Protokoll enthält zwei wichtige Schritte. Eine, die nach Bereichen mit dünnem Glaseis sucht, die homogene Partikel enthalten. Und zweitens, die Einrichtung einer parallelen Beleuchtung für die Datenerfassung.
Mit hochauflösenden Rekonstruktionen von Proteinen, die zwei bis drei Angström in Auflösung erreichen, sind Sie besser in der Lage, die molekularen Mechanismen der Krankheit zu verstehen und die Wirkstoffleitungen zu verbessern. Bisher war die Kristallisation notwendig, wenn man die strukturellen Grundlagen biologischer Phänomene untersuchen wollte. Heute ist das mit Cryo-EM nicht mehr nötig.
Und so ermöglichen wir es Wissenschaftlern mit Cryo-EM, ein breiteres Spektrum biologischer Phänomene auf struktureller Ebene zu untersuchen.
