Fluoreszenzbasierte Membranpotential-Assays bieten robuste Methoden zur Untersuchung der Auswirkungen von Modulatoren auf Ionenkanäle, die in Epithelzellen endogen exprimiert werden. Als Proof of Concept messen wir die Funktion zweier Ionenkanäle in bekannten Epithelzelllinien. Dieser Assay ist vielseitig einsetzbar, da er eine exogene chemische Sonde verwendet, um die Funktion von Ionenkanälen zu messen, wodurch die Notwendigkeit genetisch kodierter Sonden umgangen wird.
Diese Hochdurchsatz-Assays können die Auswirkungen von niedermolekularen Modulatoren auf Ionenkanäle identifizieren und charakterisieren, die das Potenzial haben, Therapien für Mukoviszidose voranzutreiben. Zu Beginn werden Calu-3- und Caco-2-Zellen in einem T75-Kolben mit EMEM mit 20 % fötalem Kälberserum und 1 % Penicillin-Streptomycin kultiviert. Saugen Sie das Medium aus dem T75-Kolben ab, nachdem die Zellen eine Konfluenz von 80 bis 100 % erreicht haben.
Waschen Sie die Zellen vorsichtig mit 10 Millilitern phosphatgepufferter Kochsalzlösung. Geben Sie dann 2 Milliliter vorgewärmtes 0,25%iges Trypsin mit 0,1%EDTA in die Zellmonoschicht. Stellen Sie den Kolben für etwa fünf Minuten auf 37 Grad Celsius.
Stellen Sie in diesem Schritt sicher, dass sich die Zellen von der Kolbenoberfläche abheben und in die Einzelzellsuspension dissoziieren. Fügen Sie 8 Milliliter Nährmedium hinzu, um die Reaktion zu neutralisieren. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 30 bis 40 % erreicht haben, geben Sie 1,5 Milliliter der Zellsuspension zu 18,5 Milliliter Nährmedium in ein konisches Röhrchen und mischen Sie.
Geben Sie 200 Mikroliter dieser Zellsuspension in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte, um etwa 140.000 Zellen pro Well zu erhalten. Um eine volle 384-Well-Platte zu plattieren, fügen Sie 1 Milliliter der Zellsuspension zu 17 Millilitern des Nährmediums in einem konischen Röhrchen hinzu, um etwa 50.000 Zellen pro Well zu erhalten. Geben Sie nach dem Mischen 50 Mikroliter der Zellsuspension in jede Vertiefung.
Wechseln Sie das Medium alle zwei Tage und stellen Sie sicher, dass die Zellen innerhalb von drei bis fünf Tagen in allen Vertiefungen gleichzeitig eine 100%ige Konfluenz erreichen. Wechseln Sie das Medium 24 Stunden vor den funktionellen Studien. Bereiten Sie zunächst die natrium- und chloridfreie Pufferlösung mit den im Textprotokoll aufgeführten Reagenzien vor.
Geben Sie die Reagenzien in doppelt destilliertes Wasser in Gewebekulturqualität. Lassen Sie die Reagenzien auflösen, indem Sie über Nacht bei Raumtemperatur umrühren. Nachdem die Lösung stabil ist, stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein, indem Sie 1 molare NMDG-Lösung tropfenweise hinzufügen.
Mischen Sie 30 Minuten lang und stellen Sie die Osmolarität der Lösung auf einen Bereich von 300 plus oder minus 5 Millimol pro Kilogramm ein. Filtern und lagern Sie die Pufferlösung in sterilen Flaschen. Dann werden 0,5 Milligramm des Membranpotentialfarbstoffs in 1 Milliliter natriumfreiem, chloridfreiem Puffer gelöst und die Lösung auf 37 Grad Celsius erwärmt.
Entfernen Sie das Nährmedium von den Calu-3- und Caco-2-Zellmonolagen. Fügen Sie 195 Mikroliter der Farbstofflösung pro Well für die 96-Well-Platte und 95 Mikroliter pro Well für eine 384-Well-Platte hinzu. Lassen Sie die Zellen den Farbstoff 35 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid beladen.
Führen Sie dann Fluoreszenzmessungen mit Anregung bei 530 Nanometern und Emission bei 560 Nanometern durch. Führen Sie zunächst fünf Minuten lang kontinuierliche Basismessungen in 30-Sekunden-Intervallen durch. Geben Sie dann 5 Mikroliter 400 mikromolare Forskolin-Lösung in jede Vertiefung der 96-Well-Platte, um eine endgültige Forskolin-Konzentration von einem Mikromolar zu erhalten.
Für die 384-Well-Platte werden fünf Mikroliter der 20 mikromolaren Forskolin-Lösung hinzugefügt. Nehmen Sie 20 Minuten lang eine Stimulationsbewertung mit Messungen in 15-Sekunden-Intervallen vor. Als nächstes werden 5 Mikroliter einer 400 Mikromolaren Lösung des CFTR-Inhibitors in die 96-Well-Platte gegeben, um eine Endkonzentration von 10 Mikromolaren zu erhalten.
Fügen Sie der 384-Well-Platte 5 Mikroliter eines 200 mikromolaren CFTR-Inhibitors hinzu. Nehmen Sie 15 Minuten lang eine Hemmungsmessung mit Messungen in 30-Sekunden-Intervallen vor. Quantifizieren Sie die Fluoreszenzintensitätsmessungen der einzelnen Vertiefungen und exportieren Sie die Werte als Tabelle.
im Spaltenformat, das einzelne Vertiefungen enthält. Um die Forskolin-induzierten Änderungen zu berechnen, dividieren Sie die relativen Fluoreszenzeinheitenmessungen aus jedem Well der 96-Well-Platte durch die letzte Fluoreszenzintensitätsmessung des Ausgangswerts und stellen Sie sie grafisch dar. Messen Sie die Peak-Antworten als maximale Fluoreszenzintensität, gemessen ab dem Ausgangswert während der Forskolin-Stimulation.
Verwenden Sie diese Messung oder den Bereich unter der Kurve, um die CFTR-Antwort zu quantifizieren. Die CFTR-Funktion wurde als Membrandepolarisation nach Forskolin-Stimulation in Caco-2-Zellen nachgewiesen. Der Fluoridausfluss wurde als starker Anstieg der Fluoreszenz im Vergleich zu DMSO als Fahrzeugsteuerung detektiert.
Nach der Forskolin-Stimulation wurde das Fluoreszenzsignal bis zur Zugabe von CFTR-Inhibitor aufrechterhalten, woraufhin die Fluoreszenzintensität rapide abnahm. Dieses Phänomen war sowohl in Caco-2- als auch in Calu-3-Zellen reproduzierbar. Die CFTR-Aktivität wurde als Differenz in der maximalen Fluoreszenzänderung nach Forskolin- oder DMSO-Stimulation berechnet.
Einzelne Punkte lagen zwischen plus oder minus 3 Standardabweichungen vom Mittelwert bei der Forskolin-Stimulation und der DMSO-Kontrolle, was auf die Reproduzierbarkeit des Assays hinweist. Um die Spezifität der funktionellen Antworten zu bestätigen, können diese Membranpotential-Assays mit konventionellen elektrophysiologischen Methoden, wie z.B. der Ussing-Kammer, weiter validiert werden. Diese Plattform ist in der Lage, die Lücke zwischen Hochdurchsatz-Modulator-Screens und heterologen Expressionssystemen und zeitaufwändigen bioelektrischen Messungen in schwer zugänglichen Primärgeweben zu schließen.
