Die MycoPatt-Methode ermöglicht eine eingehende Erforschung der arbuskulären Mykorrhizabesiedlung in Wurzeln. Mykorrhizakarten weisen auf Pilzausdehnung hin und stellen die reale Position jeder Struktur als spezifisches Muster dar. Die Mykorrhizabesiedlung wird objektiv mit einer Auflösung von 1% analysiert.
Jedes Wurzelsegment wird automatisch in eine digitale Matrix umgewandelt und generiert eine umfangreiche Datenbank mit Kolonisationsparametern. Entfernen Sie zunächst die Wurzeln aus dem Kühlschrank und legen Sie sie zum Auftauen bei Raumtemperatur auf eine Arbeitsplattform. Um die Wurzelreinigung durchzuführen, legen Sie alle Wurzeln einer Pflanze in ein 30- bis 50-Milliliter-Glas, bereiten Sie dann eine 10% ige Natronlauge mit Leitungswasser vor und gießen Sie sie in das Glas, bis sie die Wurzeln vollständig bedeckt.
Schütteln Sie das Glas kräftig für ein bis zwei Minuten, um eine homogene Verteilung der Reinigungslösung in den Wurzeln zu erhalten. Lassen Sie die Wurzeln 48 Stunden in der Clearing-Lösung verbleiben. Zum Wurzelspülen den Inhalt des Glases durch ein Sieb leiten.
Spülen Sie die Wurzeln mehrmals in Leitungswasser ab, bis die Reinigungslösung vollständig entfernt ist. Als nächstes legen Sie die gespülten Wurzeln zum Färben in ein sauberes Glas. Dann bereiten Sie eine fünf- bis fünfprozentige Tintenessiglösung mit Leitungswasser vor.
Gießen Sie es in das Glas, bis es die Wurzeln bedeckt und schütteln Sie es für ein bis zwei Minuten. Nach 48 Stunden zur teilweisen Entfärbung spülen Sie die fleckigen Wurzeln ein bis zwei Minuten lang in Leitungswasser ab. Schütteln Sie das Glas kräftig, um die zusätzliche Färbelösung zu entfernen.
Wiederholen Sie den Vorgang, bis die Wurzeln für die mikroskopische Beurteilung frei sind. Für die Wurzelsegmentierung legen Sie die gefärbten Wurzeln auf ein schuppiges Schneidebrett. Schneiden Sie die Wurzeln in einen Zentimeter Segmente.
Wählen Sie 15 Segmente für jede Variante. Als nächstes verteilen Sie die Wurzeln auf einem Objektträger zur Segmentvorbereitung, verwenden Sie einen Laminierbeutel, um die Wurzeln abzudecken, und zerkleinern Sie sie vorsichtig, beginnend von einer Kante. Verwenden Sie ein Werkzeug aus weichem Kunststoff, um die Wurzeln auf dem Objektträger anzuzeigen.
Entfernen Sie vorsichtig den Laminierbeutel und decken Sie die Probe mit einem Abdeckschein ab. Fügen Sie Wasser mit einer Pipette in eine Ecke der Rutsche und lassen Sie das Wasser langsam auf der Rutsche verteilen. Entfernen Sie das zusätzliche Wasser mit einem Papiertuch.
Verwenden Sie für die mikroskopische Analyse ein Mikroskop, das mit einer Kamera mit guter Auflösung ausgestattet ist. Analysieren Sie die Objektträger ausgehend von einer Extremität. Erfassen Sie jedes mikroskopische Feld.
Verwenden Sie die 10- oder 40-fache Vergrößerung für dicke Wurzeln und die 40-fache für dünne Wurzeln. Benennen Sie nach der Aufnahme jedes Bild mit einem Code um, der die tatsächliche Nachmontage von Stammteilen ermöglicht. Verwenden Sie eine Präsentationssoftware, um ein Zeichenbrett für die Bildzusammenstellung zu entwerfen, stellen Sie die Breite zwei bis drei Zentimeter weiter als die Bildbreite ein.
Nachdem Sie 15 Bilder aufgenommen haben, fügen Sie alle aufgenommenen Bilder eines Segments in der Reihenfolge ihrer Aufnahme hinzu, beginnend mit eins bis 15, und rekonstruieren Sie die gesamte Länge des Stammsegments. Verwenden Sie als Nächstes die vertikale Ausrichtung, um die Bilder in der Mitte auszurichten und sicherzustellen, dass jedes Bild dem vorherigen folgt. Platzieren Sie ein Raster von 10 x 150 Zellen auf allen Bildern, um das gesamte Wurzelsegment abzudecken.
Platzieren Sie zusätzlich ein 10 x 10-Raster auf jedem Bild und fügen Sie in jede Zelle dieses Gitters eine Zahl von eins bis sechs ein, wenn eine arbuskuläre Mykorrhiza- oder AM-Struktur sichtbar ist, oder lassen Sie das Feld leer, wenn keine AM-Struktur vorhanden ist. Fügen Sie eine Tabelle für ein Raster mit einer Breite von 10 Zellen und einer Länge von 150 Zellen hinzu. Ändern Sie die Tabelle mit den Abmessungen in die Breite der Bilder, und ändern Sie dann die Länge der Tabelle so, dass sie alle Bilder umfasst.
Um die Mykorrhizakolonisation zu bewerten, verwenden Sie die eindeutige Zahl, um jeden Strukturtyp zu bewerten, wie in der Mykorrhizamustermethode beschrieben. Verwenden Sie eine für Hyphen, zwei für Arbuskeln, drei für Vesikel, vier für Sporen, fünf für Hilfszellen und sechs für Eintrittspunkte. Bewerten Sie jede beobachtete Mykorrhizastruktur aus jeder Zelle der zuvor angewendeten Gitter.
Fügen Sie nach der Bewertung alle erhaltenen Ergebnisse in die MycoPatt-Tabelle ein. Verwenden Sie die Funktion zum Kopieren von Einfüge, um alle Partituren aus der Präsentation in das erste Blatt mit dem Namen Rohdaten zu übertragen. Verwenden Sie für die Primäranalyse das dritte Blatt mit dem Namen Parameter, um die Ergebnisse als Prozentsätze separat in drei Formen zu visualisieren.
Verwenden Sie die Spalten A bis K, um das horizontale Bild der Kolonisation zu analysieren, die Spalten M bis W für das vertikale Bild der Kolonisation und die Spalten Y bis AI, um die transversale Kolonisation für jedes der 15 10 x 10 Quadrate und die endgültige durchschnittliche Kolonisation zu analysieren. Wenden Sie als Nächstes die Definitionen und Formeln an, die für jeden Parameter spezifisch sind. Für die Erstellung und Extraktion von Mykorrhizakarten visualisieren Sie das Bild, das Sie aus der Umwandlung des Codes für Mykorrhizastrukturen in Farben im zweiten Blatt mit dem Namen Graphen erhalten.
Exportieren Sie dann das resultierende Bild im Diagrammblatt als Bild und verwenden Sie den Farbcode in der Legende, um Mykorrhizamuster zu analysieren. Für die Mykorrhiza-Kartenanalyse identifizieren Sie die wichtigsten Strukturen und deren Zusammensetzung. Beschreiben Sie dann das Mykorrhiza-Besiedlungsmuster, das in den analysierten Wurzeln beobachtet wurde, gefolgt von einer Kolonisationsstrategie, die auf der beobachteten strukturellen Entwicklung in der Wurzel, dem Verzweigungsmuster und der arbuskulären Vesikelentwicklung basiert.
Dieses Protokoll liefert die Details der Mykorrhizastrukturen mit gutem Kontrast zwischen Mykorrhizastrukturen und Wurzelzellen für Zea mays und Festal rubra. Die erfolglosen Reinigungs- und Färbevorgänge führten zu unklaren mikroskopischen Bildern von Mykorrhizastrukturen in Festal rubra und Zea mays. Mykorrhiza-Kolonisationsmuster ermöglichten eine vollständige Erforschung des Kolonisationsmechanismus, diese Methode bietet eine tiefe, kleinräumige Erforschung von Kolonisationsmustern und -strategien für Zea mays und Festuca rubra mit einem zusätzlichen visuellen Ausdruck von Kolonisationsparametern.
Bei Zea mays stark schwankendes Besiedlungspotential in Abhängigkeit vom Entwicklungsstadium der Pflanze wurde beobachtet, während bei Festuca rubra die Besiedlungsprozesse innerhalb der Wurzeln stattfinden und die Entwicklung von Hyphennetzwerken mit einer geringen Entwicklungsgeschwindigkeit der Wurzeln korrelierte. MycoPatt eignet sich zur Kartierung der arbuskulären Mykorrhizabesiedlung in jeder Pflanze. Es ist auch hilfreich, den Kolonisationsmechanismus vollständig zu erforschen und die Pilzstrategie entlang der Wurzeln zu bewerten.
