Diese Technik kann Myelin in Hirngewebeschnitten abbilden. Myelinisierung spielt eine wichtige Rolle bei der Leitung von Aktionspotentialen und das Verständnis von Myelin wird uns helfen, die Gehirnfunktion zu verstehen. Der Hauptvorteil der CARS-Technik gegenüber beispielsweise der Elektronenmikroskopie besteht darin, dass CARS eine lichtmikroskopische Technik ist und leicht mit anderen Fluoreszenzbildgebungsverfahren, wie sie in der Immunhistochemie verwendet werden, kombiniert werden kann.
Mehrere Erkrankungen sind auf Veränderungen der Myelinisierung zurückzuführen, zum Beispiel Multiple Sklerose, Alterung und Autismus. Das Verständnis dieser Veränderungen wird uns helfen, die zugrunde liegenden medizinischen Bedingungen zu verstehen. In diesem Fall ist der CARS-Laser darauf abgestimmt, Lipide oder insbesondere CH2-Bindungen abzubilden.
Im Gehirn ist die größte Quelle von Lipiden Myelin. Dies ist also eine Technik, um Myelin im Hirngewebe abzubilden. Es sollte möglich sein, die gleiche Methode für andere Gewebearten zu verwenden, wenn die Bildgebung von Lipiden von Interesse ist.
Das Tuning und Ausrichten des CARS-Lasers erfordert erhebliches Fachwissen und wird am besten von einem Laser- oder Lichtmikroskopie-Experten durchgeführt. Nachdem Sie die Gewebe wie im Manuskript beschrieben vorbereitet haben, färben Sie frei schwebende Abschnitte für Nisel- und Antikörpermedien, um Zellkörper sichtbar zu machen, und inkubieren Sie die Schnitte dann auf einem Standard-Laborschüttler für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Bevor Sie die Proben zum Mikroskop bringen, schalten Sie den CARS-Laser ein und erwärmen ihn für mindestens eine Stunde, richten Sie dann den CARS-Laser aus, indem Sie die Pumpe räumlich überlappen und Laserstrahlen schüren, und passen Sie die Verzögerung zwischen den beiden Laserstrahlen an.
Färben Sie die Kondensatoroptik und die Membran des Mikroskops für die vorwärts gerichtete CARS-Bildgebung und stellen Sie dann das externe Periskop so ein, dass die räumlich überlappenden zwei Laser auf die scannenden Kopfspiegel des Mikroskops zentriert werden. Für beste vorwärts gerichtete CARS nicht gescannte Erkennung. Stellen Sie sicher, dass der Kondensator farblich angelockt ist.
Für Immunfluoreszenz, konfokale Bildgebung und CARS-Bildgebung können Sie den CARS-Laser sowohl mit nicht descannten Forward- als auch mit epi-CARS-Detektoren ausstatten, indem Sie ein konfokales Mikroskop mit sichtbaren Lasern für die Fluoreszenzbildgebung integrieren. Legen Sie nun die Abschnitte in eine Kulturschale mit einem Deckboden und PBS, um das Austrocknen des Gewebes zu vermeiden. Verwenden Sie auch ein Glasgewicht, um das Gewebe in der Nähe des Abdeckstreifens zu halten.
Legen Sie über die grafische Benutzeroberfläche die Bilderfassungsparameter für die konfokale Bildgebung von Autos und Raketenfluoreszenz fest. Legen Sie die Probe auf den Mikroskoptisch, fokussieren Sie die Probe und nehmen Sie die Bilder auf. Die Spektren von CARS reichen von 640 bis 660 Nanometern und es scheint keine Überlappung der Spektren mit niselmarkierten Immunfluoreszenzmarkern zu geben, was darauf hindeutet, dass CARS-Signale mit immunfluoreszierenden Signalen verwendet werden können.
Nisel wurde verwendet, um die Zellkörper mongolischer Rennmaus- und Mausgehirne zu visualisieren, und CARS-Bildgebung wurde verwendet, um die Myelinscheide zu visualisieren, was darauf hindeutet, dass diese Technik artenübergreifend verwendet werden könnte. Beide Bildgruppen zeigen einen Ausschnitt des medialen Kerns des Trapezkörpers im Hirnstamm. Die Auflösung von CARS ist geringer als beim Elektronenmikroskop und liegt in der Größenordnung von mehreren hundert Nanometern.
Die Bilder können mit Standard-Bildanalysesoftware wie ImageJ analysiert werden, um die interessierenden Parameter zu quantifizieren, z. B. Myelindicke oder -länge.
