Die Hochdurchsatzherstellung von monodispersen Mikrogelbausteinen für mikroporös geglühte Partikelgerüste bietet eine verbesserte Kontrolle der Gerüstporosität. Dies kann sich auf die Porengröße und die nachfolgenden Gewebeintegrationsergebnisse auswirken. Dieses Protokoll verwendet einen mikrofluidischen Ansatz mit hohem Durchsatz, um große Mengen an monodispersen Mikrogelen zu erzeugen, die mit anderen Methoden wie strömungsfokussierender Mikrofluidik, Batch-Emulsion und Elektrospritzen nicht erreicht werden können.
Die erzeugten Mikrogele können zu mikroporös geglühten Partikelgerüsten geformt werden, die aufgrund der Porosität im Zellmaßstab, die ein schnelles Gewebe und Wachstum ermöglicht, für Anwendungen der regenerativen Medizin von Vorteil sind. Beginnen Sie mit der Vorbereitung eines Glasobjektträgers pro PDMS-Mikrofluidikgerät. Verwenden Sie Klebeband, gefilterte Luft oder Isopropylalkoholwäschen, um Staub vom Objektträger zu entfernen.
Legen Sie einen Objektträger in einem PDMS-Gerätedesign nebeneinander auf einen 96-Well-Plattendeckel und legen Sie ihn in einen Plasmareiniger. Schließen Sie die Tür und das Luftstromventil und schalten Sie die Vakuumpumpe ein. Lassen Sie es mindestens 30 Sekunden laufen und schalten Sie es dann aus.
Verbinden Sie den Sauerstofftankgasschlauch mit dem Luftstromventil. Lassen Sie die Plasmakammer 30 Sekunden lang mit Sauerstoff füllen, schalten Sie dann den Sauerstoff aus und schließen Sie das Luftstromventil. Schalten Sie die Vakuumpumpe ein und stellen Sie den Hochfrequenzpegel auf hoch.
Warten Sie, bis die Kammer violettrosa Farbe annimmt, und lassen Sie 30 Sekunden verstreichen. Wenn der Timer ausgeht, schalten Sie das Plasma und das Vakuum aus und öffnen Sie dann langsam das Luftstromventil, um das Vakuum freizugeben. Nehmen Sie das Fach aus dem Plasmareiniger.
Drehen Sie das PDMS-Gerät vorsichtig auf den Glasobjektträger, um sie zu verkleben. Beachten Sie während der Verklebung den leichten Unterschied in der Transparenz des PDMS. Für beste Ergebnisse lagern Sie die geklebten Geräte bei 60 Grad Celsius bis unmittelbar vor Gebrauch.
Bereiten Sie die Oberflächenbehandlung vor, indem Sie PFOCTS und Novec-Öl verdünnen und einen Milliliter für drei bis vier Geräte verwenden. Übertragen Sie das Volumen auf eine Ein-Milliliter-Spritze und befestigen Sie eine 25-Gauge-Nadel. Schneiden Sie ein 10 bis 12 Zentimeter großes Stück Tygon-Schläuche pro Gerät ab.
Schneiden Sie ein Stück PEEK-Schlauch von etwa einem Zoll Länge ab. Führen Sie ein paar Millimeter des PEEK-Schlauchs in das Ende des Tygon-Schlauchs ein, um zu verhindern, dass die Nadel die Tygon-Schlaucheinlässe durchsticht. Nehmen Sie die Geräte aus der beheizten Kammer und führen Sie das Nicht-PEEK-Ende des Tygon-Rohrs in das wässrige Einlassloch ein.
Führen Sie die Nadel der Oberflächenbehandlungsspritze in den PEEK-Schlauch ein und decken Sie das Ölkammerauslassloch ab. Injizieren Sie die Behandlung langsam und stellen Sie sicher, dass sie das Gerät ohne Blasen füllt. Warten Sie, bis sich zuerst die wässrigen Kammern gefüllt haben, gefolgt von den kleineren Kanälen und dann der Ölkammer.
Entfernen Sie den Tygon-Schlauch vom Gerät. Sobald das Gerät gefüllt ist, lassen Sie es 10 Minuten bei Raumtemperatur ruhen. Füllen Sie eine Fünf-Milliliter-Spritze nur mit Öl und befestigen Sie eine 25-Gauge-Nadel.
Saugen Sie die Oberflächenbehandlung durch die Ein- und Auslässe aus dem Gerät ab. Führen Sie Tygon-Schläuche in den wässrigen Einlass ein. Führen Sie die Spritze mit Öl in den PEEK-Schlauch ein und spülen Sie jedes Gerät mit Öl.
Saugen Sie das Öl aus dem Gerät ab. Wiederholen Sie die Ölspülung zweimal und entfernen Sie den Tygon-Schlauch. Führen Sie das Nicht-PEEK-Ende des Tygon-Schlauchs in die Einlässe der mikrofluidischen Geräte ein.
Führen Sie das restliche Stück Tygon-Schläuch ohne PEEK-Schlauch am Ende in den Ausgang des mikrofluidischen Geräts ein. Fügen Sie mindestens drei Milliliter Öl zu einer Fünf-Milliliter-Kunststoffspritze hinzu und befestigen Sie sie an einer 25-Gauge-Nadel. Führen Sie die Nadel vorsichtig in den PEEK-Schlauch an einem der Tygon-Einlässe ein.
Spülen Sie den Schlauch und das Gerät vorsichtig mit Öl. Sammeln Sie das Öl aus dem Auslass in einem konischen Rohr. Wiederholen Sie die Ölspülung am anderen Tygon-Einlass.
Stellen Sie die Spritzenpumpen auf die gewünschten Durchflussraten ein. Verbinden Sie die Spritze mit dem Tensid über eine 25-Gauge-Nadel mit dem Öleinlass und dosieren Sie vorsichtig genug Öl, um den Schlauch und den Ölkanal des mikrofluidischen Geräts zu grundieren. Sobald das Gerät und die Öleinlässe eingerichtet sind, fügen Sie 0,5 Milliliter Öl zu einer neuen Fünf-Milliliter-Spritze hinzu, die den Gelvorläufer enthält.
Verwenden Sie diese kleine Menge Öl, um die Vorläuferlösung durch das mikrofluidische Gerät zu spülen. In einem konischen Röhrchen werden 1,5 Milliliter der PEG-Rückgratlösung und 1,5 Milliliter der Vernetzerlösung kombiniert. 30 Sekunden lang vorziehen und die kombinierte Gelvorläuferlösung schnell in die Fünf-Milliliter-Spritze überführen.
Verbinden Sie die Spritze mit der Gelvorläuferlösung über eine 25-Gauge-Nadel mit dem wässrigen Einlass. Dosieren Sie vorsichtig genug Lösung, um den Schlauch und den wässrigen Kanal zu grundieren. Klemmen Sie die Spritzen auf die Spritzenpumpen und drücken Sie den Lauf.
Suchen Sie nach Partikeln einheitlicher Größe aus den Kanälen. Sammeln Sie die Mikrogele aus dem Auslass in einem konischen Röhrchen. Sobald die Gelierung abgeschlossen ist, verwenden Sie eine Pipette, um die Ölphase vorsichtig vom Boden des Röhrchens zu entfernen.
Legen Sie diese in einen geeigneten Abfallbehälter für fluorierte Abfälle. Fügen Sie mehr Öl in das Mikrogel-Sammelröhrchen hinzu. Mischen Sie, indem Sie das Sammelrohr vorsichtig umdrehen.
Lassen Sie das Sammelröhrchen fünf Minuten ruhen, damit sich die Phasen trennen können. Suchen Sie nach der Ölphase unten und der wässrigen Mikrogelphase oben. Wiederholen Sie die Ölwäschen mindestens zweimal mehr.
Fügen Sie mehr Öl mit dem Gel hinzu, wie zuvor gezeigt, und fügen Sie dann PBS zum Gel hinzu. Mehrmals umkehren, um zu mischen. Um die Schichten zu trennen, zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 2.000 RCF für etwa 30 Sekunden.
Suchen Sie nach der Ölphase am Boden des Röhrchens, Gel in der Mitte und PBS oben. Entfernen Sie die Ölphase mit einer Pipette und entsorgen Sie sie in einem Abfallbehälter. Öl wiederholen und PBS zweimal waschen.
Suchen Sie nach dem Gel, um durch die letzte Wäsche von undurchsichtig zu klar überzugehen. Entfernen Sie das gesamte Öl. Entfernen Sie PBS nicht aus dem konischen Rohr.
Verwenden Sie in einem chemischen Abzug eine Glaspipette, um dem Rohr Hexane in einem gleichen Volumen wie das PBS hinzuzufügen. Wirbeln Sie das konische Rohr für 30 Sekunden oder bis es gründlich gemischt ist. Zentrifugieren Sie bei 4, 696 RCF für fünf Minuten.
Suchen Sie nach der Trennung nach Hexanen in der oberen Schicht, PBS in der Mitte und Gel in der Unterseite. Entfernen Sie die Hexanschicht und entsorgen Sie sie in einem Behälter für organische Abfälle. Saugen Sie die PBS ab.
Wiederholen Sie Hexan in PBS-Waschungen mindestens zweimal oder bis das Gel fast durchscheinend erscheint. Waschen Sie das Gel erneut mit PBS, um verbleibende Hexanrückstände zu entfernen. Zentrifugieren Sie bei 4, 696 RCF für fünf Minuten und saugen Sie die PBS-Schicht ab.
Etwa 67-75% des 20 Kilodalton PEG-Maleimids wurden mit funktionellen Methacrylamidgruppen modifiziert, um eine hohe Glüheffizienz zu gewährleisten. Die prozentuale Modifikation wurde durch Analyse von 1H-NMR-Spektrenpeaks bestimmt. Der Beginn der Gelierung gab Aufschluss über die Dauer der mikrofluidischen Mikrogelbildung.
Es wird empfohlen, einen Gelvorläufer-pH-Wert zu wählen, der die Gelierung zwischen 30 Minuten und zwei Stunden initiieren kann. Nach Reinigung und Quellung hatten die Mikrogele eine einheitliche Größe und einen Polydispersitätsindex zwischen 1,00 und 1,02, definiert als monodisperse Population. Nach dem Glühen bildeten die Mikrogele ein poröses Gerüst, das mit Zwei-Photonen-Mikroskopie sichtbar gemacht wurde.
Die korrekte Verklebung des PDMS-Geräts mit dem Glasobjektträger und die korrekte Oberflächenbehandlung des Geräts sind entscheidend für die beste mikrofluidische Geräteleistung. Diese Technik ermöglicht die schnelle Herstellung einheitlicher Mikrogelbausteine zu Kartengerüsten, die für eine Vielzahl von regenerativen In-vivo-Anwendungen, einschließlich der Wundheilung, verwendet werden können.
