La fabbricazione ad alta produttività di blocchi costitutivi in microgel monodispersi per scaffold di particelle ricotto microporose fornisce un maggiore controllo della porosità dello scaffold. Ciò può influire sulla dimensione dei pori e sui successivi risultati dell'integrazione tissutale. Questo protocollo utilizza un approccio microfluidico ad alto rendimento per generare grandi volumi di microgel monodispersi che non possono essere raggiunti con altri metodi come la microfluidica a focalizzazione del flusso, l'emulsione batch e l'elettrospruzzatura.
I microgel generati possono essere formati in scaffold di particelle ricotto microporose che sono vantaggiosi per le applicazioni di medicina rigenerativa a causa della porosità della scala cellulare che consente una rapida crescita e dei tessuti. Iniziare preparando un vetrino per ogni dispositivo microfluidico PDMS. Utilizzare nastri adesivi, aria filtrata o lavaggi con alcool isopropilico per rimuovere la polvere dal vetrino.
Posizionare un vetrino in un dispositivo PDMS affiancato all'altro su un coperchio a piastra a 96 pozzetti e posizionarlo in un detergente al plasma. Chiudere la porta e la valvola del flusso d'aria e accendere la pompa per vuoto. Lascia funzionare per almeno 30 secondi, quindi spegnilo.
Collegare il tubo del gas del serbatoio dell'ossigeno alla valvola del flusso d'aria. Lasciare riempire la camera al plasma di ossigeno per 30 secondi, quindi spegnere l'ossigeno e chiudere la valvola del flusso d'aria. Accendere la pompa per vuoto e impostare il livello di radiofrequenza su alto.
Attendere che la camera diventi di colore rosa viola e lasciare passare 30 secondi. Quando il timer si spegne, spegnere il plasma e aspirare, quindi aprire lentamente la valvola del flusso d'aria per rilasciare il vuoto. Rimuovere il vassoio dal detergente al plasma.
Capovolgere delicatamente il dispositivo PDMS sul vetrino per incollarli. Mentre avviene l'incollaggio, osservare la leggera differenza nella trasparenza del PDMS. Per ottenere i migliori risultati, conservare i dispositivi incollati a 60 gradi Celsius fino a immediatamente prima dell'uso.
Preparare il trattamento superficiale diluendo PFOCTS e olio Novec e utilizzare un millilitro per tre o quattro dispositivi. Trasferire il volume in una siringa da un millilitro e inserire un ago da 25 gauge. Tagliare un pezzo di tubo Tygon da 10 a 12 centimetri per dispositivo.
Tagliare un pezzo di tubo PEEK lungo circa un pollice. Inserire un paio di millimetri del tubo in PEEK all'estremità del tubo Tygon per evitare che l'ago fori le prese dei tubi Tygon. Estrarre i dispositivi dalla camera riscaldata e inserire l'estremità non PEEK del tubo Tygon nel foro di ingresso acquoso.
Inserire l'ago della siringa per il trattamento superficiale nel tubo in PEEK e coprire il foro di uscita della camera dell'olio. Iniettare il trattamento lentamente e assicurarsi che riempia il dispositivo senza bolle. Attendere che le camere acquose si riempiano prima, seguite dai canali più piccoli e poi dalla camera dell'olio.
Rimuovere il tubo Tygon dal dispositivo. Una volta riempito il dispositivo, lasciarlo riposare per 10 minuti a temperatura ambiente. Riempire una siringa da cinque millilitri solo con olio e collegare un ago da 25 gauge.
Aspirare il trattamento superficiale dal dispositivo attraverso gli ingressi e l'uscita. Inserire il tubo Tygon nell'ingresso acquoso. Inserire la siringa con olio nel tubo PEEK e lavare ogni dispositivo con olio.
Aspirare l'olio dal dispositivo. Ripetere il lavaggio dell'olio due volte e rimuovere il tubo Tygon. Inserire l'estremità non PEEK del tubo Tygon negli ingressi dei dispositivi microfluidici.
Inserire il pezzo rimanente del tubo Tygon senza tubo PEEK all'estremità nell'uscita del dispositivo microfluidico. Aggiungere almeno tre millilitri di olio a una siringa di plastica da cinque millilitri e collegarla a un ago da 25 gauge. Inserire con cautela l'ago nel tubo in PEEK su una delle prese Tygon.
Lavare delicatamente il tubo e il dispositivo con olio. Raccogliere l'olio dall'uscita in un tubo conico. Ripetere il flusso dell'olio sull'altra entrata di Tygon.
Impostare le pompe a siringa sulle portate desiderate. Collegare la siringa contenente il tensioattivo all'ingresso dell'olio tramite un ago da 25 gauge ed erogare delicatamente abbastanza olio per innescare il tubo e il canale dell'olio del dispositivo microfluidico. Una volta installato il dispositivo e le prese dell'olio, aggiungere 0,5 millilitri di olio a una nuova siringa da cinque millilitri che conterrà il precursore del gel.
Utilizzare questa piccola quantità di olio per aiutare a lavare la soluzione precursore attraverso il dispositivo microfluidico. In un tubo conico, combinare 1,5 millilitri della soluzione dorsale PEG e 1,5 millilitri della soluzione reticolante. Vortice per 30 secondi e trasferire rapidamente la soluzione combinata di precursori del gel alla siringa da cinque millilitri.
Collegare la siringa con la soluzione di precursore del gel all'ingresso acquoso tramite un ago da 25 gauge. Erogare delicatamente una soluzione sufficiente per innescare il tubo e il canale acquoso. Bloccare le siringhe sulle pompe a siringa e premere il funzionamento.
Cerca particelle di dimensioni uniformi dai canali. Raccogliere i microgel dalla presa in un tubo conico. Una volta completata la gelificazione, utilizzare una pipetta per rimuovere con attenzione la fase dell'olio dal fondo del tubo.
Depositarlo in un contenitore appropriato per i rifiuti fluorurati. Aggiungere altro olio nel tubo di raccolta del microgel. Mescolare capovolgendo delicatamente il tubo di raccolta.
Lasciare riposare il tubo di raccolta per cinque minuti per consentire alle fasi di separarsi. Cerca la fase oleosa in basso e la fase microgel acquosa in alto. Ripetere i lavaggi dell'olio almeno due volte di più.
Aggiungere più olio con il gel come dimostrato in precedenza, quindi aggiungere PBS al gel. Capovolgere per mescolare più volte. Per separare gli strati, centrifugare il tubo a 2.000 RCF per circa 30 secondi.
Cerca la fase dell'olio nella parte inferiore del tubo, il gel al centro e il PBS in alto. Rimuovere la fase dell'olio con una pipetta e gettarla in un contenitore per i rifiuti. Ripetere l'olio e i lavaggi PBS due volte.
Cerca che il gel passi da opaco a trasparente entro il lavaggio finale. Rimuovere tutto l'olio. Non rimuovere PBS dal tubo conico.
In una cappa aspirante chimica, utilizzare una pipetta di vetro per aggiungere esano al tubo con un volume uguale al PBS. Vortice il tubo conico per 30 secondi o fino a quando non viene miscelato accuratamente. Centrifugare a 4.696 RCF per cinque minuti.
Dopo la separazione, cercare esani nello strato superiore, PBS nel mezzo e gel nella parte inferiore. Rimuovere lo strato di esano e gettarlo in un contenitore per rifiuti organici. Aspirare il PBS.
Ripetere l'esano nei lavaggi PBS almeno due volte o fino a quando il gel appare quasi traslucido. Lavare nuovamente il gel con PBS per rimuovere eventuali residui di esano. Centrifugare a 4.696 RCF per cinque minuti e aspirare lo strato PBS.
Circa il 67-75% dei 20 kilodalton PEG maleimmide è stato modificato con gruppi funzionali di metacrilammide per garantire un'elevata efficienza di ricottura. La modifica percentuale è stata determinata analizzando i picchi spettrali NMR 1H. L'inizio della gelificazione ha fornito informazioni sulla durata della generazione di microgel microfluidici.
Si consiglia di scegliere il pH precursore del gel che può iniziare la gelificazione tra 30 minuti e due ore. Dopo la purificazione e il gonfiore, i microgel avevano una dimensione uniforme e un indice di polidispersità tra 1,00 e 1,02 definito come popolazione monodispersa. Dopo la ricottura, i microgel hanno formato un'impalcatura porosa visualizzata con microscopia a due fotoni.
L'incollaggio corretto del dispositivo PDMS al vetrino e il corretto trattamento superficiale del dispositivo sono fondamentali per le migliori prestazioni del dispositivo microfluidico. Questa tecnica consente una rapida produzione di blocchi di microgel uniformi per formare scaffold cartografici che possono essere utilizzati per una varietà di applicazioni rigenerative in vivo, compresa la guarigione delle ferite.
