Mikro gözenekli tavlanmış parçacık iskeleleri için monodispers mikrojel yapı taşlarının yüksek verimli üretimi, iskele gözenekliliğinin daha iyi kontrol edilmesini sağlar. Bu, gözenek boyutunu ve sonraki doku entegrasyon sonuçlarını etkileyebilir. Bu protokol, akış odaklı mikroakışkanlar, toplu emülsiyon ve elektropüskürtme gibi diğer yöntemlerle elde edilemeyen büyük hacimli monodispers mikrojeller üretmek için yüksek verimli bir mikroakışkan yaklaşım kullanır.
Üretilen mikrojeller, hızlı doku ve büyümeye izin veren hücre ölçeği gözenekliliği nedeniyle rejeneratif tıp uygulamaları için avantajlı olan mikro gözenekli tavlanmış parçacık iskeleleri halinde oluşturulabilir. PDMS mikroakışkan cihaz başına bir cam slayt hazırlayarak başlayın. Slayttaki tozları temizlemek için bant, filtrelenmiş hava veya izopropil alkollü yıkamalar kullanın.
PDMS cihaz tasarım slaytına 96 delikli bir plaka kapağında yan yana bir cam slayt yerleştirin ve bir plazma temizleyiciye yerleştirin. Kapıyı ve hava akış valfini kapatın ve vakum pompasını açın. En az 30 saniye çalışmasına izin verin, ardından kapatın.
Oksijen tankı gaz tüpünü hava akış valfine bağlayın. Plazma odasının 30 saniye boyunca oksijenle dolmasına izin verin, ardından oksijeni kapatın ve hava akış valfini kapatın. Vakum pompasını açın ve radyo frekansı seviyesini yüksek olarak ayarlayın.
Oda mor pembe rengine dönene kadar bekleyin ve 30 saniye geçmesine izin verin. Zamanlayıcı söndüğünde, plazmayı ve vakumlamayı kapatın, ardından vakumu serbest bırakmak için hava akış valfini yavaşça açın. Tepsiyi plazma temizleyiciden çıkarın.
PDMS cihazını yapıştırmak için yavaşça cam kızağın üzerine çevirin. Yapıştırma gerçekleştikçe, PDMS'nin şeffaflığındaki küçük farkı gözlemleyin. En iyi sonuçlar için, bağlı cihazları kullanımdan hemen öncesine kadar 60 santigrat derecede saklayın.
PFOCTS ve Novec yağını seyrelterek yüzey işlemini hazırlayın ve üç ila dört cihaz için bir mililitre kullanın. Hacmi bir mililitrelik bir şırıngaya aktarın ve 25 gauge'lik bir iğne takın. Cihaz başına 10 ila 12 santimetrelik bir Tygon boru parçası kesin.
Yaklaşık bir inç uzunluğunda bir parça PEEK borusu kesin. İğnenin Tygon boru girişlerini delmesini önlemek için Tygon borusunun ucuna birkaç milimetrelik PEEK borusu yerleştirin. Cihazları ısıtılmış odadan çıkarın ve Tygon borusunun PEEK olmayan ucunu sulu giriş deliğine yerleştirin.
Yüzey işleme şırıngasının iğnesini PEEK borusuna yerleştirin ve yağ odası çıkış deliğini örtün. Tedaviyi yavaşça enjekte edin ve cihazı kabarcıklar olmadan doldurduğundan emin olun. Önce sulu odaların dolmasını, ardından daha küçük kanalların ve ardından yağ odasının dolmasını bekleyin.
Tygon borusunu cihazdan çıkarın. Cihaz doldurulduktan sonra, oda sıcaklığında 10 dakika dinlendirin. Beş mililitrelik bir şırıngayı sadece yağ ile doldurun ve 25 gauge'lik bir iğne takın.
Yüzey işlemini cihazdan giriş ve çıkıştan aspire edin. Tygon borusunu sulu girişe yerleştirin. Şırıngayı PEEK borusuna yağ ile yerleştirin ve her cihazı yağ ile yıkayın.
Yağı cihazdan aspire edin. Yağ yıkamayı iki kez tekrarlayın ve Tygon borusunu çıkarın. Tygon borusunun PEEK olmayan ucunu mikroakışkan cihazların girişlerine yerleştirin.
Ucunda PEEK borusu olmayan kalan Tygon boru parçasını mikroakışkan cihaz çıkışına yerleştirin. Beş mililitrelik plastik şırıngaya en az üç mililitre yağ ekleyin ve 25 gauge iğneye takın. İğneyi Tygon girişlerinden birindeki PEEK borusuna dikkatlice yerleştirin.
Boruyu ve cihazı yavaşça yağla yıkayın. Yağı çıkıştan konik bir tüp içinde toplayın. Diğer Tygon girişindeki yağ yıkama işlemini tekrarlayın.
Şırınga pompalarını istenen akış hızlarına ayarlayın. Yüzey aktif maddeyi içeren şırıngayı 25 gauge'lik bir iğne ile yağ girişine bağlayın ve mikroakışkan cihazın borusunu ve yağ kanalını beslemek için yeterli yağı yavaşça dağıtın. Cihaz ve yağ girişleri kurulduktan sonra, jel öncüsünü içerecek yeni bir beş mililitrelik şırıngaya 0,5 mililitre yağ ekleyin.
Öncü çözeltinin mikroakışkan cihazdan temizlenmesine yardımcı olması için bu az miktarda yağı kullanın. Konik bir tüpte, 1,5 mililitre PEG omurga çözeltisini ve 1,5 mililitre çapraz bağlayıcı çözeltisini birleştirin. 30 saniye boyunca vorteks yapın ve kombine jel öncü çözeltisini beş mililitrelik şırıngaya hızlı bir şekilde aktarın.
Şırıngayı jel öncü çözeltisi ile 25 gauge iğne ile sulu girişe bağlayın. Boruyu ve sulu kanalı astarlamak için yeterli çözeltiyi yavaşça dağıtın. Şırıngaları şırınga pompalarına kelepçeleyin ve çalıştırmaya basın.
Kanallardan eşit büyüklükte parçacıklar arayın. Mikrojelleri prizden konik bir tüp içinde toplayın. Jelasyon tamamlandıktan sonra, yağ fazını tüpün altından dikkatlice çıkarmak için bir pipet kullanın.
Bunu florlu atıklar için uygun bir atık kabına koyun. Mikrojel toplama tüpüne daha fazla yağ ekleyin. Toplama tüpünü hafifçe ters çevirerek karıştırın.
Fazların ayrılmasına izin vermek için toplama tüpünün beş dakika boyunca yerleşmesine izin verin. Alttaki yağ fazını ve üstteki sulu mikrojel fazını arayın. Yağ yıkamalarını en az iki kez daha tekrarlayın.
Daha önce gösterildiği gibi jel ile daha fazla yağ ekleyin, ardından jele PBS ekleyin. Birkaç kez karıştırmak için ters çevirin. Katmanları ayırmak için, tüpü yaklaşık 30 saniye boyunca 2.000 RCF'de santrifüj yapın.
Tüpün altındaki yağ fazını, ortadaki jeli ve üstte PBS'yi arayın. Yağ fazını bir pipetle çıkarın ve bir atık kabına atın. Yağı tekrarlayın ve PBS iki kez yıkar.
Son yıkamada jelin opaklıktan temizlemeye geçmesini bekleyin. Tüm yağı çıkarın. PBS'yi konik tüpten çıkarmayın.
Kimyasal bir davlumbazda, PBS'ye eşit hacimde tüpe hekzan eklemek için bir cam pipet kullanın. Konik tüpü 30 saniye boyunca veya iyice karışana kadar vorteksleyin. Beş dakika boyunca 4.696 RCF'de santrifüj yapın.
Ayırmadan sonra, üst katmanda altıgenler, ortada PBS ve altta jel arayın. Hekzan tabakayı çıkarın ve organik atık için bir kaba atın. PBS'yi aspire edin.
PBS'de hekzanı tekrarlayın, en az iki kez veya jel neredeyse yarı saydam görünene kadar yıkar. Kalan hekzan kalıntılarını gidermek için jeli PBS ile bir kez daha yıkayın. Beş dakika boyunca 4.696 RCF'de santrifüj yapın ve PBS tabakasını aspire edin.
20 kilodalton PEG maleimidin yaklaşık% 67-75'i, yüksek tavlama verimliliği sağlamak için metakrilamit fonksiyonel grupları ile modifiye edildi. Yüzde modifikasyonu, 1H NMR spektrum zirveleri analiz edilerek belirlendi. Jelleşmenin başlangıcı, mikroakışkan mikrojel üretiminin süresi hakkında fikir verdi.
30 dakika ile iki saat arasında jelleşmeyi başlatabilen jel öncüsü pH'ın seçilmesi önerilir. Saflaştırma ve şişmeden sonra, mikrojeller monodisperse bir popülasyon olarak tanımlanan 1.00 ila 1.02 arasında eşit bir boyuta ve polidispersite indeksine sahipti. Tavlamadan sonra, mikrojeller iki foton mikroskobu ile görselleştirilen gözenekli bir iskele oluşturdu.
PDMS cihazının cam kızağa doğru şekilde bağlanması ve cihazın doğru şekilde yüzeye işlenmesi, en iyi mikroakışkan cihaz performansı için çok önemlidir. Bu teknik, yara iyileşmesi de dahil olmak üzere çeşitli in vivo rejeneratif uygulamalar için kullanılabilecek harita iskeleleri oluşturmak için üniform mikrojel yapı taşlarının hızlı bir şekilde üretilmesini sağlar.
