A fabricação de alto rendimento de blocos de construção de microgel monodispers para andaimes de partículas recíprocas microporos fornecem um controle aprimorado da porosidade do andaime. Isso pode afetar o tamanho dos poros e os resultados subsequentes de integração tecidual. Este protocolo usa uma abordagem microfluida de alto rendimento para gerar grandes volumes de microgéis monodispersados que não podem ser alcançados com outros métodos, como microfluidos com foco de fluxo, emulsão em lote e eletros rezando.
Os microgésis gerados podem ser formados em andaimes de partículas recadas microporos que são vantajosos para aplicações de medicina regenerativa devido à porosidade da escala celular que permite tecido rápido e crescimento. Comece preparando um slide de vidro por dispositivo microfluido PDMS. Use fita, ar filtrado ou lavações de álcool isopropílico para remover qualquer poeira do slide.
Coloque um slide de vidro em um dispositivo PDMS deslize um ao lado do outro em uma tampa de placa de 96 poços e coloque-o em um limpador de plasma. Feche a porta e a válvula de fluxo de ar e ligue a bomba de vácuo. Deixe-o correr por pelo menos 30 segundos, e depois desligue.
Conecte o tubo de gás do tanque de oxigênio à válvula de fluxo de ar. Deixe a câmara de plasma encher com oxigênio por 30 segundos, depois desligue o oxigênio e feche a válvula de fluxo de ar. Ligue a bomba de vácuo e coloque o nível de frequência de rádio em alta.
Espere até que a câmara vire uma cor rosa violeta e deixe passar 30 segundos. Quando o temporizador se apagar, desligue o plasma e o vácuo e, em seguida, abra lentamente a válvula de fluxo de ar para liberar o vácuo. Remova a bandeja do limpador de plasma.
Vire suavemente o dispositivo PDMS sobre a lâmina de vidro para relacioná-los. À medida que a ligação acontece, observe a pequena diferença na transparência do PDMS. Para obter os melhores resultados, armazene os dispositivos ligados a 60 graus Celsius até imediatamente antes do uso.
Prepare o tratamento superficial diluindo o óleo PFOCTS e Novec e use um mililitro para três a quatro dispositivos. Transfira o volume para uma seringa de um mililitro e conecte uma agulha de calibre 25. Corte um pedaço de 10 a 12 centímetros de tubulação Tygon por dispositivo.
Corte um pedaço de tubo PEEK aproximadamente uma polegada de comprimento. Insira um par de milímetros da tubulação PEEK na extremidade da tubulação Tygon para evitar que a agulha punca as entradas de tubos de Tygon. Tire os dispositivos da câmara aquecida e insira a extremidade não-PEEK da tubulação Tygon no orifício aquoso da entrada.
Insira a agulha da seringa de tratamento de superfície na tubulação PEEK e cubra o orifício de saída da câmara de óleo. Injete o tratamento lentamente e certifique-o de encher o dispositivo sem bolhas. Aguarde as câmaras aquosas para encher primeiro, seguido pelos canais menores e depois pela câmara de petróleo.
Remova a tubulação Tygon do dispositivo. Uma vez que o dispositivo tenha sido preenchido, deixe descansar por 10 minutos em temperatura ambiente. Encha uma seringa de cinco mililitros apenas com óleo e conecte uma agulha calibre 25.
Aspire o tratamento superficial para fora do dispositivo através das entradas e saída. Insira tubos de Tygon na entrada aquosa. Insira a seringa com óleo na tubulação PEEK e lave cada dispositivo com óleo.
Aspire o óleo do dispositivo. Repita a descarga de óleo duas vezes e remova a tubulação Tygon. Insira a extremidade não-PEEK da tubulação Tygon nas entradas dos dispositivos microfluidos.
Insira o restante da tubulação Tygon sem tubo PEEK na extremidade na saída do dispositivo microfluido. Adicione pelo menos três mililitros de óleo a uma seringa de plástico de cinco mililitros e fixe-a a uma agulha calibre 25. Insira cuidadosamente a agulha na tubulação PEEK em uma das entradas tygon.
Lave suavemente a tubulação e o dispositivo com óleo. Recolhe o óleo da tomada em um tubo cônico. Repita a descarga de óleo na outra entrada Tygon.
Coloque as bombas de seringa nas taxas de fluxo desejadas. Conecte a seringa contendo o surfactante à entrada de óleo através de uma agulha de calibre 25 e distribua suavemente óleo suficiente para preparar a tubulação e o canal de óleo do dispositivo microfluido. Uma vez que o dispositivo e as entradas de óleo tenham sido configuradas, adicione 0,5 mililitros de óleo a uma nova seringa de cinco mililitros que conterá o precursor do gel.
Use esta pequena quantidade de óleo para ajudar a lavar a solução precursora através do dispositivo microfluido. Em um tubo cônico, combine 1,5 mililitros da solução de backbone PEG e 1,5 mililitros da solução cross-linker. Vórtice por 30 segundos e transfira rapidamente a solução precursora de gel combinada para a seringa de cinco mililitros.
Conecte a seringa com a solução precursora do gel à entrada aquosa através de uma agulha de calibre 25. Dispense suavemente solução suficiente para preparar a tubulação e o canal aquoso. Fixar as seringas nas bombas de seringa e pressionar a execução.
Procure partículas de tamanho uniforme dos canais. Colete os microgéis da tomada em um tubo cônico. Uma vez que a gelação esteja completa, use uma pipeta para remover cuidadosamente a fase do óleo da parte inferior do tubo.
Deposite isso em um recipiente de resíduos apropriado para resíduos fluorados. Adicione mais óleo no tubo de coleta de microgel. Misture invertendo suavemente o tubo de coleta.
Deixe o tubo de coleta se contentar por cinco minutos para permitir que as fases se separem. Procure a fase do óleo na parte inferior e a fase aquosa do microgel na parte superior. Repita as lavagens de óleo pelo menos duas vezes mais.
Adicione mais óleo com o gel como demonstrado anteriormente, em seguida, adicione PBS ao gel. Inverta para misturar várias vezes. Para separar as camadas, centrifugar o tubo a 2.000 RCF por cerca de 30 segundos.
Procure a fase de óleo na parte inferior do tubo, gel no meio e PBS por cima. Remova a fase do óleo com uma pipeta e descarte-a em um recipiente de resíduos. Repita o óleo e o PBS lave duas vezes.
Procure o gel para a transição de opaco para claro até a lavagem final. Remova todo o óleo. Não remova o PBS do tubo cônico.
Em uma capa de fumaça química, use uma pipeta de vidro para adicionar hexanos ao tubo em um volume igual ao PBS. Vórtice o tubo cônico por 30 segundos ou até que esteja completamente misturado. Centrifugar a 4.696 RCF por cinco minutos.
Após a separação, procure hexanes na camada superior, PBS no meio e gel na parte inferior. Remova a camada de hexano e descarte-a em um recipiente para resíduos orgânicos. Aspire a PBS.
Repetir o hexano no PBS lava pelo menos duas vezes ou até que o gel pareça quase translúcido. Lave o gel com PBS mais uma vez para remover qualquer resíduo de hexano restante. Centrifugar a 4.696 RCF por cinco minutos e aspirar a camada PBS.
Cerca de 67-75% dos 20 kilodalton PEG maleimide foram modificados com grupos funcionais de metanfetamina para garantir uma alta eficiência de ressarcer. A modificação percentual foi determinada analisando os picos de espectros 1H NMR. O início da gelação forneceu uma visão da duração da geração de microgel microfluido.
Recomenda-se escolher pH precursor de gel que pode iniciar a gelação entre 30 minutos e duas horas. Após a purificação e inchaço, os microgels apresentaram tamanho uniforme e índice de polidispersidade entre 1,00 e 1,02 definido como população monodispersada. Após a ressarização, os microgel formaram um andaime poroso visualizado com microscopia de dois fótons.
A conexão correta do dispositivo PDMS ao slide de vidro e o tratamento correto do dispositivo é crucial para o melhor desempenho do dispositivo microfluido. Esta técnica permite a produção rápida de blocos de construção de microgel uniformes para formar andaimes de mapa que podem ser usados para uma variedade de aplicações regenerativas in vivo, incluindo a cicatrização da ferida.
