La fabricación de alto rendimiento de bloques de construcción de microgel monodispersos para andamios de partículas recocidas microporosas proporciona un control mejorado de la porosidad del andamio. Esto puede afectar el tamaño de los poros y los resultados posteriores de integración de tejidos. Este protocolo utiliza un enfoque microfluídico de alto rendimiento para generar grandes volúmenes de microgeles monodispersos que no se pueden lograr con otros métodos como la microfluídica de enfoque de flujo, la emulsión por lotes y la electropulverización.
Los microgeles generados se pueden formar en andamios de partículas recocidas microporosas que son ventajosas para aplicaciones de medicina regenerativa debido a la porosidad a escala celular que permite un rápido crecimiento y tejido. Comience preparando un portaobjetos de vidrio por dispositivo microfluídico PDMS. Use cinta adhesiva, aire filtrado o lavados con alcohol isopropílico para eliminar el polvo del portaobjetos.
Coloque un portaobjetos de vidrio en un diseño de dispositivo PDMS, deslícese uno al lado del otro en una tapa de placa de 96 pocillos y colóquelo en un limpiador de plasma. Cierre la puerta y la válvula de flujo de aire y encienda la bomba de vacío. Déjelo funcionar durante al menos 30 segundos y apáguelo.
Conecte el tubo de gas del tanque de oxígeno a la válvula de flujo de aire. Deje que la cámara de plasma se llene de oxígeno durante 30 segundos, luego apague el oxígeno y cierre la válvula de flujo de aire. Encienda la bomba de vacío y ajuste el nivel de radiofrecuencia a alto.
Espere hasta que la cámara se vuelva de color rosa violeta y deje pasar 30 segundos. Cuando el temporizador se apague, apague el plasma y el vacío, luego abra lentamente la válvula de flujo de aire para liberar el vacío. Retire la bandeja del limpiador de plasma.
Voltee suavemente el dispositivo PDMS sobre la diapositiva de vidrio para unirlos. A medida que ocurre la unión, observe la ligera diferencia en la transparencia del PDMS. Para obtener los mejores resultados, guarde los dispositivos unidos a 60 grados centígrados hasta inmediatamente antes de su uso.
Prepare el tratamiento de la superficie diluyendo PFOCTS y aceite Novec y use un mililitro para tres o cuatro dispositivos. Transfiera el volumen a una jeringa de un mililitro y coloque una aguja de calibre 25. Corte una pieza de 10 a 12 centímetros de tubo Tygon por dispositivo.
Corte un trozo de tubo de PEEK de aproximadamente una pulgada de largo. Inserte un par de milímetros del tubo PEEK en el extremo del tubo Tygon para evitar que la aguja perfore las entradas del tubo Tygon. Saque los dispositivos de la cámara calentada e inserte el extremo no PEEK del tubo Tygon en el orificio de entrada acuoso.
Inserte la aguja de la jeringa de tratamiento de superficie en el tubo PEEK y cubra el orificio de salida de la cámara de aceite. Inyecte el tratamiento lentamente y asegúrese de que llene el dispositivo sin burbujas. Espere a que las cámaras acuosas se llenen primero, seguidas de los canales más pequeños y luego la cámara de aceite.
Retire el tubo Tygon del dispositivo. Una vez que el dispositivo se haya llenado, déjelo reposar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Llene una jeringa de cinco mililitros solo con aceite y coloque una aguja de calibre 25.
Aspire el tratamiento de la superficie fuera del dispositivo a través de las entradas y salidas. Inserte el tubo Tygon en la entrada acuosa. Inserte la jeringa con aceite en el tubo PEEK y enjuague cada dispositivo con aceite.
Aspire el aceite del dispositivo. Repita el lavado de aceite dos veces y retire el tubo Tygon. Inserte el extremo no PEEK del tubo Tygon en las entradas de los dispositivos microfluídicos.
Inserte la pieza restante del tubo Tygon sin tubo PEEK en el extremo en la salida del dispositivo microfluídico. Agregue al menos tres mililitros de aceite a una jeringa de plástico de cinco mililitros y conéctela a una aguja de calibre 25. Inserte cuidadosamente la aguja en el tubo PEEK de una de las entradas Tygon.
Enjuague suavemente el tubo y el dispositivo con aceite. Recoja el aceite de la salida en un tubo cónico. Repita la descarga de aceite en la otra entrada Tygon.
Ajuste las bombas de jeringa a los caudales deseados. Conecte la jeringa que contiene el surfactante a la entrada de aceite a través de una aguja de calibre 25 y dispense suavemente suficiente aceite para cebar el tubo y el canal de aceite del dispositivo microfluídico. Una vez que se hayan configurado el dispositivo y las entradas de aceite, agregue 0,5 mililitros de aceite a una nueva jeringa de cinco mililitros que contendrá el precursor del gel.
Use esta pequeña cantidad de aceite para ayudar a eliminar la solución precursora a través del dispositivo microfluídico. En un tubo cónico, combine 1,5 mililitros de la solución troncal PEG y 1,5 mililitros de la solución reticulante. Vortex durante 30 segundos y transfiera rápidamente la solución combinada de precursor de gel a la jeringa de cinco mililitros.
Conecte la jeringa con la solución precursora de gel a la entrada acuosa a través de una aguja de calibre 25. Dispense suavemente suficiente solución para cebar el tubo y el canal acuoso. Sujete las jeringas a las bombas de jeringa y presione ejecutar.
Busque partículas de tamaño uniforme de los canales. Recoja los microgeles de la salida en un tubo cónico. Una vez completada la gelificación, utilice una pipeta para retirar cuidadosamente la fase oleosa del fondo del tubo.
Deposite esto en un contenedor de residuos apropiado para residuos fluorados. Agregue más aceite en el tubo de recolección de microgel. Mezclar invirtiendo suavemente el tubo de recolección.
Deje que el tubo de recolección se asiente durante cinco minutos para permitir que las fases se separen. Busque la fase oleosa en la parte inferior y la fase acuosa de microgel en la parte superior. Repita los lavados con aceite al menos dos veces más.
Agregue más aceite con el gel como se demostró anteriormente, luego agregue PBS al gel. Invertir para mezclar varias veces. Para separar las capas, centrifugar el tubo a 2, 000 RCF durante unos 30 segundos.
Busque la fase oleosa en la parte inferior del tubo, el gel en el medio y PBS en la parte superior. Retire la fase oleosa con una pipeta y deséchela en un contenedor de residuos. Repita el aceite y los lavados de PBS dos veces.
Busque que el gel pase de opaco a claro por el lavado final. Retire todo el aceite. No retire PBS del tubo cónico.
En una campana extractora de humos químicos, use una pipeta de vidrio para agregar hexanos al tubo a un volumen igual al PBS. Vortex el tubo cónico durante 30 segundos o hasta que se mezcle bien. Centrífuga a 4, 696 RCF durante cinco minutos.
Después de la separación, busque hexanos en la capa superior, PBS en el medio y gel en la parte inferior. Retire la capa de hexano y deséchela en un recipiente para residuos orgánicos. Aspirar el PBS.
Repita el hexano en los lavados PBS al menos dos veces o hasta que el gel parezca casi translúcido. Lave el gel con PBS una vez más para eliminar cualquier residuo de hexano restante. Centrifugar a 4, 696 RCF durante cinco minutos y aspirar la capa de PBS.
Alrededor del 67-75% de la maleimida PEG de 20 kilodalton se modificó con grupos funcionales de metacrilamida para garantizar una alta eficiencia de recocido. El porcentaje de modificación se determinó analizando los picos de espectros de RMN 1H. El inicio de la gelificación proporcionó información sobre la duración de la generación de microgel microfluídico.
Se recomienda elegir un pH precursor de gel que pueda iniciar la gelificación entre 30 minutos y dos horas. Después de la purificación y el hinchamiento, los microgeles tuvieron un tamaño uniforme y un índice de polidispersidad entre 1,00 y 1,02 definido como una población monodispersa. Después del recocido, los microgeles formaron un andamio poroso visualizado con microscopía de dos fotones.
La unión correcta del dispositivo PDMS al portaobjetos de vidrio y el tratamiento correcto de la superficie del dispositivo es crucial para el mejor rendimiento del dispositivo microfluídico. Esta técnica permite la producción rápida de bloques de construcción de microgel uniformes para formar andamios de mapas que se pueden utilizar para una variedad de aplicaciones regenerativas in vivo, incluida la cicatrización de heridas.
