미세 다공성 어닐링 입자 스캐폴드를 위한 단분산 마이크로겔 빌딩 블록의 고처리량 제조는 스캐폴드 다공성의 향상된 제어를 제공합니다. 이것은 기공 크기와 후속 조직 통합 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. 이 프로토콜은 고처리량 미세유체 접근법을 사용하여 유동 초점 미세유체학, 배치 에멀젼 및 전기 분무와 같은 다른 방법으로는 달성할 수 없는 대량의 단분산 미세겔을 생성합니다.
생성된 마이크로겔은 빠른 조직 및 성장을 허용하는 세포 규모 다공성으로 인해 재생 의학 응용 분야에 유리한 미세 다공성 어닐링된 입자 스캐폴드로 형성될 수 있습니다. PDMS 미세유체 장치당 하나의 유리 슬라이드를 준비하는 것으로 시작합니다. 테이프, 여과된 공기 또는 이소프로필 알코올 세척제를 사용하여 슬라이드에서 먼지를 제거합니다.
PDMS 장치 설계 슬라이드의 유리 슬라이드를 96웰 플레이트 덮개에 나란히 놓고 플라즈마 클리너에 넣습니다. 도어와 공기 흐름 밸브를 닫고 진공 펌프를 켭니다. 최소 30초 동안 실행한 다음 끕니다.
산소 탱크 가스 튜브를 공기 흐름 밸브에 연결합니다. 플라즈마 챔버에 30초 동안 산소를 채운 다음 산소를 끄고 기류 밸브를 닫습니다. 진공 펌프를 켜고 무선 주파수 레벨을 높음으로 설정하십시오.
챔버가 보라색 분홍색으로 변할 때까지 기다렸다가 30 초가 지날 때까지 기다리십시오. 타이머가 꺼지면 플라즈마와 진공을 끈 다음 공기 흐름 밸브를 천천히 열어 진공을 해제합니다. 플라즈마 클리너에서 트레이를 제거합니다.
PDMS 장치를 유리 슬라이드에 부드럽게 뒤집어 접착합니다. 결합이 발생하면 PDMS의 투명도에 약간의 차이가 있음을 관찰하십시오. 최상의 결과를 얻으려면 사용 직전까지 접합된 장치를 섭씨 60도에서 보관하십시오.
PFOCTS 및 Novec 오일을 희석하여 표면 처리를 준비하고 3-4 개의 장치에 1 밀리리터를 사용하십시오. 부피를 1 밀리리터 주사기로 옮기고 25 게이지 바늘을 부착하십시오. 장치 당 10-12 센티미터의 Tygon 튜브를 자릅니다.
PEEK 튜브 조각을 약 1인치 길이로 자릅니다. 바늘이 Tygon 튜브 입구에 구멍을 뚫는 것을 방지하기 위해 Tygon 튜브 끝에 PEEK 튜브의 몇 밀리미터를 삽입합니다. 가열 된 챔버에서 장치를 꺼내고 Tygon 튜브의 PEEK가 아닌 끝을 수성 입구 구멍에 삽입합니다.
표면 처리 주사기의 바늘을 PEEK 튜브에 삽입하고 오일 챔버 출구 구멍을 덮습니다. 트리트먼트를 천천히 주입하고 기포 없이 장치를 채우는지 확인합니다. 수성 챔버가 먼저 채워질 때까지 기다린 다음 더 작은 채널과 오일 챔버가 채워질 때까지 기다리십시오.
장치에서 타이곤 튜브를 제거합니다. 장치가 채워지면 실온에서 10 분 동안 그대로 두십시오. 5 밀리리터 주사기에 기름 만 채우고 25 게이지 바늘을 부착하십시오.
입구와 출구를 통해 장치에서 표면 처리를 흡입하십시오. 타이곤 튜브를 수성 유입구에 삽입합니다. 오일이 든 주사기를 PEEK 튜브에 삽입하고 각 장치에 오일을 세척합니다.
장치에서 오일을 흡입하십시오. 오일 세척을 두 번 반복하고 Tygon 튜브를 제거하십시오. Tygon 튜브의 PEEK가 아닌 끝을 미세 유체 장치의 입구에 삽입합니다.
끝에 PEEK 튜브가 없는 나머지 Tygon 튜브 조각을 미세 유체 장치 콘센트에 삽입합니다. 5 밀리리터 플라스틱 주사기에 최소 3 밀리리터의 오일을 넣고 25 게이지 바늘에 부착하십시오. Tygon 입구 중 하나의 PEEK 튜브에 바늘을 조심스럽게 삽입합니다.
튜브와 장치를 오일로 부드럽게 세척하십시오. 원추형 튜브의 콘센트에서 오일을 수집하십시오. 다른 Tygon 입구에서 오일 플러시를 반복합니다.
주사기 펌프를 원하는 유량으로 설정하십시오. 계면 활성제가 들어있는 주사기를 25 게이지 바늘을 통해 오일 입구에 연결하고 튜브와 미세 유체 장치의 오일 채널을 프라이밍하기에 충분한 오일을 부드럽게 분배합니다. 장치와 오일 주입구가 설치되면 젤 전구체를 포함 할 새로운 5 밀리리터 주사기에 0.5 밀리리터의 오일을 첨가하십시오.
이 소량의 오일을 사용하여 미세유체 장치를 통해 전구체 용액을 플러시하는 데 도움을 줍니다. 원추형 튜브에서 1.5 밀리리터의 PEG 백본 용액과 1.5 밀리리터의 가교 결합제 용액을 결합합니다. 30초 동안 와동시키고 혼합된 겔 전구체 용액을 5밀리리터 주사기로 신속하게 옮긴다.
25 게이지 바늘을 통해 겔 전구체 용액이 있는 주사기를 수성 입구에 연결합니다. 튜브와 수성 채널을 프라이밍하기에 충분한 용액을 부드럽게 분배합니다. 주사기를 주사기 펌프에 고정하고 실행을 누릅니다.
채널에서 균일 한 크기의 입자를 찾으십시오. 원추형 튜브의 콘센트에서 마이크로 젤을 수집합니다. 겔화가 완료되면 피펫을 사용하여 튜브 바닥에서 오일 상을 조심스럽게 제거합니다.
이것을 불소화 폐기물을 위한 적절한 폐기물 용기에 보관하십시오. 마이크로젤 수집 튜브에 오일을 더 추가합니다. 수집 튜브를 부드럽게 뒤집어 혼합합니다.
상이 분리될 수 있도록 수집 튜브를 5분 동안 그대로 두십시오. 하단의 오일 상과 상단의 수성 마이크로 겔 상을 찾으십시오. 오일 세척을 적어도 두 번 더 반복하십시오.
앞에서 설명한 것처럼 젤에 오일을 더 넣은 다음 PBS를 젤에 첨가하십시오. 여러 번 혼합하기 위해 반전하십시오. 층을 분리하려면 튜브를 2, 000 RCF에서 약 30 초 동안 원심 분리하십시오.
튜브 바닥의 오일 상, 중간의 젤, 상단의 PBS를 찾으십시오. 피펫으로 오일 상을 제거하고 폐기물 용기에 폐기하십시오. 오일과 PBS 세척을 두 번 반복하십시오.
최종 세척까지 젤이 불투명에서 투명으로 전환되는지 확인하십시오. 모든 오일을 제거하십시오. 원추형 튜브에서 PBS를 제거하지 마십시오.
화학 흄 후드에서 유리 피펫을 사용하여 PBS와 동일한 부피로 튜브에 헥산을 추가합니다. 원추형 튜브를 30 초 동안 또는 완전히 혼합 될 때까지 와동시킵니다. 4, 696 RCF에서 5 분 동안 원심 분리기.
분리 후 최상층에서 헥산, 중간에 PBS, 하단에서 젤을 찾으십시오. 헥산 층을 제거하고 유기 폐기물 용기에 버립니다. PBS를 흡인합니다.
PBS 세척에서 헥산을 적어도 두 번 또는 겔이 거의 반투명하게 보일 때까지 반복합니다. PBS로 젤을 한 번 더 씻어 남아있는 헥산 잔여 물을 제거하십시오. 4, 696 RCF에서 5 분 동안 원심 분리하고 PBS 층을 흡인합니다.
20킬로달톤 PEG 말레이미드의 약 67-75%가 메타크릴아미드 작용기로 변형되어 높은 어닐링 효율을 보장합니다. 퍼센트 변형은 1H NMR 스펙트럼 피크를 분석함으로써 결정하였다. 겔화의 시작은 미세 유체 마이크로 겔 생성 기간에 대한 통찰력을 제공했습니다.
30 분에서 2 시간 사이에 겔화를 시작할 수있는 겔 전구체 pH를 선택하는 것이 좋습니다. 정제 및 팽윤 후, 마이크로겔은 단분산 개체군으로 정의된 1.00 내지 1.02 사이의 균일한 크기 및 다분산 지수를 가졌다. 어닐링 후, 마이크로겔은 2광자 현미경으로 시각화된 다공성 스캐폴드를 형성하였다.
PDMS 장치를 유리 슬라이드에 올바르게 접착하고 장치를 올바르게 표면 처리하는 것은 최상의 미세 유체 장치 성능을 위해 매우 중요합니다. 이 기술을 사용하면 균일한 마이크로겔 빌딩 블록을 신속하게 생산하여 상처 치유를 포함한 다양한 생체 내 재생 응용 분야에 사용할 수 있는 맵 스캐폴드를 형성할 수 있습니다.
