La fabrication à haut débit de blocs de construction en microgel monodispersé pour les échafaudages de particules microporeuses recuites permet un meilleur contrôle de la porosité de l’échafaudage. Cela peut avoir un impact sur la taille des pores et les résultats ultérieurs de l’intégration tissulaire. Ce protocole utilise une approche microfluidique à haut débit pour générer de grands volumes de microgels monodispersés, ce qui ne peut pas être obtenu avec d’autres méthodes telles que la microfluidique focalisant l’écoulement, l’émulsion discontinue et l’électropulvérisation.
Les microgels générés peuvent être transformés en échafaudages de particules microporeux recuits, ce qui est avantageux pour les applications de médecine régénérative en raison de la porosité à l’échelle cellulaire qui permet une croissance rapide des tissus. Commencez par préparer une lame de verre par dispositif microfluidique PDMS. Utilisez du ruban adhésif, de l’air filtré ou des lavages à l’alcool isopropylique pour enlever la poussière de la lame.
Placez une lame de verre dans une lame de conception de dispositif PDMS l’une à côté de l’autre sur un couvercle de plaque de 96 puits et placez-la dans un nettoyeur plasma. Fermez la porte et la vanne de débit d’air et allumez la pompe à vide. Laissez-le fonctionner pendant au moins 30 secondes, puis éteignez-le.
Connectez le tube de gaz du réservoir d’oxygène à la vanne de débit d’air. Laissez la chambre à plasma se remplir d’oxygène pendant 30 secondes, puis éteignez l’oxygène et fermez la vanne de débit d’air. Allumez la pompe à vide et réglez le niveau de fréquence radio sur élevé.
Attendez que la chambre prenne une couleur rose violet et laissez passer 30 secondes. Lorsque la minuterie se déclenche, éteignez le plasma et passez l’aspirateur, puis ouvrez lentement la vanne de débit d’air pour libérer le vide. Retirez le plateau du nettoyeur plasma.
Retournez doucement le périphérique PDMS sur la lame de verre pour les coller. Au fur et à mesure que la liaison se produit, observez la légère différence dans la transparence du PDMS. Pour de meilleurs résultats, conservez les appareils collés à 60 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient immédiatement avant utilisation.
Préparez le traitement de surface en diluant les PCPP et l’huile Novec et utilisez un millilitre pour trois à quatre appareils. Transférer le volume dans une seringue d’un millilitre et fixer une aiguille de calibre 25. Coupez un morceau de tube Tygon de 10 à 12 centimètres par appareil.
Coupez un morceau de tube en PEEK d’environ un pouce de longueur. Insérez quelques millimètres du tube en PEEK à l’extrémité du tube Tygon pour empêcher l’aiguille de percer les entrées du tube Tygon. Retirez les appareils de la chambre chauffée et insérez l’extrémité non PEEK du tube Tygon dans le trou d’entrée aqueux.
Insérez l’aiguille de la seringue de traitement de surface dans le tube en PEEK et couvrez le trou de sortie de la chambre d’huile. Injectez le traitement lentement et assurez-vous qu’il remplit l’appareil sans bulles. Attendez que les chambres aqueuses se remplissent en premier, suivies des canaux plus petits, puis de la chambre à huile.
Retirez le tube Tygon de l’appareil. Une fois l’appareil rempli, laissez-le reposer pendant 10 minutes à température ambiante. Remplissez une seringue de cinq millilitres avec de l’huile seulement et fixez une aiguille de calibre 25.
Aspirez le traitement de surface hors de l’appareil par les entrées et les sorties. Insérez le tube Tygon dans l’entrée aqueuse. Insérez la seringue avec de l’huile dans le tube en PEEK et rincez chaque dispositif avec de l’huile.
Aspirez l’huile hors de l’appareil. Répétez le rinçage de l’huile deux fois et retirez le tube Tygon. Insérez l’extrémité non PEEK du tube Tygon dans les entrées des dispositifs microfluidiques.
Insérez le morceau restant de tube Tygon sans tube en PEEK à l’extrémité dans la sortie du dispositif microfluidique. Ajoutez au moins trois millilitres d’huile à une seringue en plastique de cinq millilitres et fixez-la à une aiguille de calibre 25. Insérez délicatement l’aiguille dans le tube en PEEK de l’une des entrées Tygon.
Rincez doucement le tube et l’appareil avec de l’huile. Recueillir l’huile de la sortie dans un tube conique. Répétez le rinçage de l’huile sur l’autre entrée Tygon.
Réglez les pompes à seringue sur les débits souhaités. Connectez la seringue contenant le surfactant à l’entrée d’huile à l’aide d’une aiguille de calibre 25 et distribuez doucement suffisamment d’huile pour amorcer le tube et le canal d’huile du dispositif microfluidique. Une fois l’appareil et les entrées d’huile configurés, ajoutez 0,5 millilitre d’huile à une nouvelle seringue de cinq millilitres qui contiendra le précurseur du gel.
Utilisez cette petite quantité d’huile pour aider à rincer la solution précurseur à travers le dispositif microfluidique. Dans un tube conique, combiner 1,5 millilitre de la solution de squelette PEG et 1,5 millilitre de la solution de réticulation. Vortex pendant 30 secondes et transférer rapidement la solution de précurseur de gel combiné dans la seringue de cinq millilitres.
Connectez la seringue avec la solution de précurseur du gel à l’entrée aqueuse à l’aide d’une aiguille de calibre 25. Distribuer doucement suffisamment de solution pour amorcer le tube et le canal aqueux. Fixez les seringues sur les pompes à seringue et appuyez sur Run.
Recherchez les particules de taille uniforme dans les canaux. Recueillir les microgels de la sortie dans un tube conique. Une fois la gélification terminée, utilisez une pipette pour retirer soigneusement la phase huileuse du fond du tube.
Déposez-le dans un conteneur à déchets approprié pour les déchets fluorés. Ajouter plus d’huile dans le tube de collecte de microgel. Mélanger en retournant doucement le tube de collecte.
Laissez le tube de collecte reposer pendant cinq minutes pour permettre aux phases de se séparer. Recherchez la phase huileuse en bas et la phase microgel aqueuse en haut. Répétez les lavages à l’huile au moins deux fois plus.
Ajouter plus d’huile avec le gel comme démontré précédemment, puis ajouter PBS au gel. Retourner pour mélanger plusieurs fois. Pour séparer les couches, centrifuger le tube à 2 000 RCF pendant environ 30 secondes.
Recherchez la phase huileuse au fond du tube, le gel au milieu et le PBS sur le dessus. Retirez la phase huileuse à l’aide d’une pipette et jetez-la dans un conteneur à déchets. Répétez l’huile et le PBS lavage deux fois.
Recherchez le gel pour passer d’opaque à clair avant le lavage final. Retirez toute l’huile. Ne retirez pas le PBS du tube conique.
Dans une hotte chimique, utilisez une pipette en verre pour ajouter des hexanes au tube à un volume égal à celui du PBS. Vortex le tube conique pendant 30 secondes ou jusqu’à ce qu’il soit bien mélangé. Centrifuger à 4, 696 RCF pendant cinq minutes.
Après la séparation, recherchez les hexanes dans la couche supérieure, le PBS au milieu et le gel en bas. Retirez la couche d’hexane et jetez-la dans un récipient pour déchets organiques. Aspirez le PBS.
Répétez l’hexane dans les lavages PBS au moins deux fois ou jusqu’à ce que le gel apparaisse presque translucide. Lavez le gel avec du PBS une fois de plus pour éliminer tout résidu d’hexane restant. Centrifuger à 4, 696 RCF pendant cinq minutes et aspirer la couche PBS.
Environ 67 à 75 % du maléimide PEG de 20 kilodaltons a été modifié avec des groupes fonctionnels méthacrylamide pour assurer une efficacité de recuit élevée. Le pourcentage de modification a été déterminé en analysant les pics de spectres RMN 1H. Le début de la gélification a donné un aperçu de la durée de la génération de microgel microfluidique.
Il est recommandé de choisir un pH précurseur de gel qui peut initier la gélification entre 30 minutes et deux heures. Après purification et gonflement, les microgels avaient une taille uniforme et un indice de polydispersité compris entre 1,00 et 1,02 défini comme une population monodispersée. Après recuit, les microgels ont formé un échafaudage poreux visualisé par microscopie à deux photons.
Le collage correct du dispositif PDMS à la lame de verre et le traitement de surface correct de l’appareil sont cruciaux pour obtenir les meilleures performances microfluidiques du dispositif. Cette technique permet de produire rapidement des blocs de construction de microgel uniformes pour former des échafaudages cartographiques qui peuvent être utilisés pour une variété d’applications régénératives in vivo, y compris la cicatrisation des plaies.
