Das In-vitro-Transkriptions-Assay-System für Borreliella burgdorferi bietet Forschern ein biochemisches Werkzeug zur Untersuchung von genregulatorischen Mechanismen und Faktoren, die die enzymatische Aktivität der RNA-Polymerase steuern. Das System ermöglicht es uns, zu testen, wie sich Transkriptionsfaktoren, Co-Faktoren, Salzkonzentrationen und pH-Wert auf die Funktion der RNA-Polymerase von Borreliella burgdorferi auswirken, was zu unserem allgemeinen Verständnis der genregulatorischen Mechanismen beiträgt. Diese leistungsstarke Technik kann es uns auch ermöglichen, nach Medikamenten zu suchen, die die RNA-Polymerase selektiv hemmen, was die Tür zur Entwicklung neuartiger Medikamente zur Behandlung der Lyme-Borreliose öffnet.
Sammeln Sie zunächst das Zellpellet von zwei bis vier Litern Borreliella burgdorferi RpoC-His10X, die in BSKI-Medium in einer mikroaerophilen Umgebung kultiviert wurden, auf eine Dichte von zwei bis vier mal 10 konstant pro Milliliter. Pelletieren Sie die Zellen bei 10.000 mal G für 30 Minuten bei vier Grad Celsius in 500-Milliliter-Zentrifugalflaschen und entsorgen Sie den Überstand. Anschließend werden die Zellen in 30 Milliliter eiskaltem HN-Puffer resuspendiert, der Zentrifugationsschritt wiederholt und der Überstand dekantiert.
Halten Sie die Zellen, das Lysat und die gereinigten Proteine während der Arbeit bei vier Grad Celsius oder auf Eis, es sei denn, sie frieren ein. Halten Sie die RNA-Polymerase in einer reduzierenden Umgebung, indem Sie jedem verwendeten Puffer frisch zubereitetes Dithiothreitol in einer Konzentration von zwei Millimolar hinzufügen und den pH-Wert 8,0 aufrechterhalten. Bereiten Sie Lysat aus dem Zellpellet von Borreliella burgdorferi mit einem handelsüblichen Bakterienlyse-Kit vor.
Resuspendieren Sie das Pellet in 10 bis 15 Milliliter B-PER-Lösung ohne Proteasehemmer und lassen Sie die Lyse fünf Minuten lang auf Eis laufen. Fügen Sie der Lyselösung einen Proteasehemmer-Cocktail hinzu und fahren Sie mit drei Beschallungsrunden fort. Klären Sie nun das Zelllysat durch Zentrifugation und Filtration mit einem 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.
Fügen Sie der Lösung Kobaltsäulenladepuffer hinzu, wodurch das Gesamtvolumen bis zu 30 Milliliter beträgt. Pelletieren Sie die Zelltrümmer durch Zentrifugieren bei 20.000 mal G für 30 Minuten. Anschließend wird der Überstand mit einem 0,45-Mikrometer-Spritzenvorsatzfilter filtriert und der Lysat- und Kobaltsäulenbeladungspuffer auf ein Endverdünnungsverhältnis von 1:10 verdünnt.
Führen Sie eine Affinitätschromatographie des geklärten Zelllysatüberstandes mit einer Kobalt- oder Nickelharzsäule gemäß den Anweisungen des Herstellers durch. Bewahren Sie die Durchfluss-, Wasch- und eluierten Proben für die Analyse auf. Tauschen Sie die RNA-Polymerase-Lösungspufferlösung sofort mit der Speicherpufferlösung unter Verwendung einer Pufferwechselsäule gemäß den Anweisungen des Herstellers aus.
Anschließend wird die RNA-Polymerase mit 10-Kilodalton-Cutoff-Zentrifugalfiltereinheiten auf eine Konzentration von 0,2 bis 0,4 Milligramm pro Milliliter konzentriert. Bestimmen Sie die Konzentration mit dem Spektralphotometer und bereiten Sie die Gefriervorräte vor. 20 bis 50 Mikroliter Volumen RNA-Polymerase frieren Bestände in PCR-Röhrchen ein und lagern die RNA-Polymerase bei minus 80 Grad Celsius.
Bereiten Sie die Arbeitsflächen, einschließlich der Bestrahlungsbank, vor, um die Strahlenbelastung zu reduzieren. Frische RNA-Polymerase- und RpoD-Brühen auf Eis auftauen und alle aufgetauten gefrorenen Brühen vor dem Pipettieren gründlich mischen Bereiten Sie eine Master-Reaktionsmischung in einer separaten NTP-Mischung für radioaktiv markierte Nukleotide entsprechend den experimentellen Anforderungen vor. Dispensieren Sie die Kontrollreaktionen in Versuchssets in PCR-Röhrchen.
Nachdem Wasser, Reaktionsmischung, RNA-Polymerase und RpoD in dafür vorgesehene PCR-Röhrchen dosiert wurden, mischen Sie die Reagenzien durch Pipettieren. Übertragen Sie die vorbereiteten Materialien auf eine Bestrahlungsbank, fügen Sie NTP alpha-32P-markiertes ATP hinzu und mischen Sie sie durch sanftes Pipettieren. Geben Sie NTP in die Röhrchen, die die In-vitro-Transkriptionsreaktionsgemische enthalten, und starten Sie die In-vitro-Transkriptionsreaktion durch Zugabe einer DNA-Vorlage.
Mischen Sie das Reaktionsvolumen durch leichtes Pipettieren und inkubieren Sie die Röhrchen fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem Thermocycler oder Heizblock. Entfernen Sie die Reaktionen aus dem Thermocycler oder Heizblock und stoppen Sie die In-vitro-Transkriptionsreaktionen, indem Sie dem Reaktionsgemisch ein gleiches Volumen eines 2X-RNA-Beladungsfarbstoffs mit 50 % Formamid hinzufügen. Denaturierung der Enzyme durch Inkubation von Reaktionen bei 65 Grad Celsius für fünf Minuten in einem Thermocycler oder Heizblock.
Mit Hilfe der Gelelektrophorese wird die in vitro transkribierte RNA in 10 % bis 15 % TBE-Harnstoffpolyacrylamidgele bei 180 Volt für 30 bis 45 Minuten getrennt. Nachdem Sie einen Teil des Gels entfernt haben, der nicht integriertes radioaktiv markiertes ATP enthält, setzen Sie das Gel über Nacht dem Phospho-Screening aus und bilden Sie die radioaktiv markierte RNA mit einem Phosphoscreen-Imager ab. Die SDS-PAGE zeigte drei Banden, die den drei Peptiden RpoC, RpoB und RpoA des RNA-Polymerase-Komplexes entsprechen.
Ein Peptid von 115 Kilodalton, das der Größe des MBP-markierten rekombinanten Borreliella burgdorferi RpoD entsprach, wurde ebenfalls beobachtet. Die Spaltung des Proteingemisches mit der Faktor-XA-Protease führte zur Generierung von zwei signifikanten Produkten, RpoD und MBP. Die Promotorstelle von Borreliella burgdorferi FLGB wurde mittels PCR generiert.
Eine zweifache Verdünnung der RpoD-Konzentration führt zu einem niedrigeren Gehalt des akkumulierten RNA-Produkts. Eine niedrige RNA-Polymerase-Konzentration führt zu weniger RNA-Produkten über den gesamten RpoD-Konzentrationsbereich. Das Densitometrie-Signal deutete in beiden Experimenten auf einen linearen Zusammenhang zwischen der Menge an RpoD hin, die in der Reaktion vorhanden war.
Die enzymatische Aktivität der RNA-Polymerase reagiert während des Aufreinigungs-, Lagerungs- und experimentellen Prozesses auf eine Vielzahl von Faktoren. Frische Enzyme und Reagenzien sowie eine gute Planung bieten die bestmöglichen Erfolgschancen bei diesem Protokoll.
