Organotypische Gewebeschnitte wurden aus verschiedenen Geweben erzeugt. Aufgrund der erhaltenen Gewebeintegrität und der Entwicklung von Kultivierungstechniken eignen sie sich für die Modellierung komplexer physiologischer Mechanismen. Organotypische Schnittkulturen aus Pankreaskarzinomen berechnen die multizelluläre Architektur des Tumors und seiner Mikroumgebung ex vivo genau neu.
Sie können für verschiedene nachgelagerte Anwendungen eingesetzt werden, z. B. für die Prüfung des Ansprechens auf Medikamente. Sie können unmittelbar nach der chirurgischen Resektion des Tumors kultiviert werden und sind im Vergleich zu den meisten anderen primären Kulturtechniken kostengünstig und weniger zeitaufwändig. Vorgeführt wird das Verfahren von Olha Lapshyna, technische Assistentin der Universität zu Lübeck.
Bereiten Sie zunächst 100 Milliliter niedrigschmelzende 8%ige Agarose vor, indem Sie acht Gramm Agarose in 100 Millilitern vorgewärmter Ringerlösung auflösen und bis zur Verwendung bei vier Grad Celsius lagern. Nach Ankündigung der Tumorresektion die Agarose in der Mikrowelle schmelzen. Legen Sie die Agarose in ein vorgewärmtes Wasserbad und lassen Sie sie vor der Zubereitung auf physiologische Temperaturen abkühlen.
Setzen Sie eine Rasierklinge in die Halterung des Vibratome ein und führen Sie eine automatische Winkelverstellung nach Herstellerangaben durch. Kühlen Sie den Mantel der Schneidkammer mit einem Kühlaggregat oder nassem Eis ab. Füllen Sie die Schneidkammer mit ca. 100 Millilitern Ringerlösung und legen Sie dann die montierte Rasierklinge in die vorgekühlte Schneidlösung, damit die Rasierklinge abkühlen kann.
Waschen Sie die Gewebeprobe mit abgekühltem PBS und legen Sie sie in eine 14 Zentimeter große Petrischale auf Eis. Makroskopisch sichtbares überschüssiges Bindegewebe auf Eis mit dem Skalpell entfernen. Lege das Taschentuch in eine kleine Petrischale.
Passen Sie die Gewebeausrichtung so an, dass das verbleibende makroskopisch sichtbare Bindegewebe die gleiche Ausrichtung hat wie die Ebene des Bodens der Petrischale. Gießen Sie die vorbereitete niedrigschmelzende Agarose in die kleine Petrischale, wobei Sie die Ausrichtung des Gewebes neu einstellen. Legen Sie die Petrischale bei Bedarf mit einer Pinzette auf nasses Eis, um die Agarose schneller auszuhärten.
Schneiden Sie das Gewebe vorsichtig mit einem Skalpell ab und lassen Sie mindestens fünf Millimeter umgebende Agarose auf jeder Seite des Gewebes übrig. Geben Sie Kleber auf den Probenhalter, verteilen Sie ihn, übertragen Sie das eingebettete Gewebe und kleben Sie es mit Sekundenkleber auf den Probenhalter. Setzen Sie nach einigen Sekunden den Probenhalter in die Schneidkammer ein und passen Sie bei Bedarf die Ausrichtung des Gewebes in Richtung der Rasierklinge an.
Definieren Sie die äußeren Grenzen des Schnittbereichs entsprechend der Größe der Gewebeprobe. Richten Sie die Klinge nach oben auf den Gewebeblock aus. Stellen Sie die Schnittgeschwindigkeit auf 0,04 Millimeter pro Sekunde, die Schnittamplitude auf einen Millimeter und die Scheibendicke auf 300 Mikrometer ein.
Schneiden Sie vorsichtig die ersten Scheiben ab und geben Sie die Scheiben in einen separaten Behälter mit vorgekühlter Ringerlösung auf nassem Eis. Bereiten Sie eine Sechs-Well-Platte mit einem Milliliter des entsprechenden Kultivierungsmediums pro Well vor. Legen Sie die Sechs-Well-Platte mit dem Medium in einen Inkubator und lassen Sie die Temperatur und den pH-Wert vor der Kultivierung anpassen.
Legen Sie die Scheiben mit einem Blickfilter auf die Zellkultureinsätze und entfernen Sie dann überschüssige Ringerlösung, indem Sie den geladenen Filter auf ein steriles Tuch legen. Setzen Sie den geladenen Filter in die vorbereitete Sechs-Well-Platte ein, ohne dem Einsatz zusätzliches Medium hinzuzufügen, stellen Sie dann die Sechs-Well-Platte in einen Inkubator und wechseln Sie das Medium alle zwei Tage. Platzieren Sie den Kultivierungsfilter mit der montierten Scheibe auf einer Petrischale.
Schneiden Sie mit einem Skalpell die Filtermembran vorsichtig mit der montierten Gewebescheibe aus. Übertragen Sie die Filtermembran mit der montierten Scheibe in einen Biopsie-Nylonbeutel und legen Sie ihn in eine Einbettkassette. Übertragen Sie anschließend die Einbettkassetten aus Kunststoff für mindestens 24 Stunden oder bis zur weiteren Verwendung in einen Behälter mit vorgekühltem 4,5%igem Formalin.
Spülen Sie die Formalin-fixierte Schnittkultur vorsichtig 1,5 Stunden lang mit fließendem Leitungswasser ab. Dehydrieren Sie die Formalin-fixierte Gewebescheibe durch Inkubation in 70%95% und absolutem Ethanol. Reinigen Sie dann die Formalin-Fixgewebescheibe mit zwei dreistündigen Inkubationen in Xylol.
Tauchen Sie das Gewebe über Nacht bei 60 Grad Celsius mit Paraffin und dann noch einmal für zwei Stunden. Betten Sie das Gewebe in einen Paraffinblock in eine Gewebeeinbettungsform ein und legen Sie es auf Eis, um die Probe schneller abzukühlen. Schneiden Sie den in Paraffin eingebetteten Gewebeblock in vier Mikrometer Dicke mit einem Mikrotom und in einem 40 Grad Celsius warmen Wasserbad mit destilliertem Wasser.
Übertragen Sie die Ausschnitte auf Objektträger. Inkubieren Sie Paraffinabschnitte eine Stunde lang bei 60 Grad Celsius, um das Gewebe mit dem Glas zu verbinden. Inkubieren Sie die Objektträger dann über Nacht bei 37 Grad Celsius.
Die Schnitte werden durch dreimalige Inkubation in Xylol für jeweils fünf Minuten entparaffiniert. Rehydrieren Sie dann durch aufeinanderfolgende Inkubationen in absolutem Alkohol, 95 % Alkohol und 70 % Alkohol. Die Abschnitte fünf Minuten lang in Mayer Hämatoxylin-Lösung einfärben und 10 Minuten lang mit fließendem Leitungswasser nachspülen.
In 0,5%iger ESN-Lösung 40 Sekunden lang gegenfärben und mit destilliertem Wasser abspülen, dann die Dehydrierung in Ethanol wiederholen. Reinigen Sie das Gewebe in drei Wechseln von Xylol für jeweils einige Sekunden, geben Sie dann einen Tropfen Eindeckmedium hinzu und bedecken Sie die Objektträger mit einem Deckglas. Die makroskopische Morphologie jedes OTSC nahm während der Kultivierung für sechs Tage ab.
Die für OTSCs gespeicherte Lebensfähigkeit von zwei repräsentativen Primärtumoren in zwei verschiedenen Medien zeigte eine Abnahme der Lebensfähigkeit nach dem Tag Null aufgrund des Schnittverfahrens und der Anpassung an die Kulturbedingungen, sowie eine Erhöhung der Lebensfähigkeit der Tumorprobe im rechten Panel. H&E-Färbeschnitte zeigten, dass die Gesamtstruktur des Gewebes über die gesamte Zeit der Kultivierung ex vivo erhalten blieb und dass während des Kulturzeitraums von sechs Tagen keine groben Veränderungen der Proliferation und Apoptose festgestellt wurden. Die mikroskopische histopathologische Auswertung von H&E-Schnitten ergab keinen signifikanten Anstieg der Nekrose aller kultivierten Gewebe während der Kultivierung.
Es gab eine Zunahme gespaltener Caspase-3-positiver Zellen nach Kultivierung eines primären duktalen Adenokarzinoms (PDAC) des Pankreas für 15 Tage. Die Histopathologie einer Peritonealmetastase eines PDAC zeigte eine hohe intratumorale Heterogenität zwischen den einzelnen Schnitten sowie eine natürlich vorkommende Apoptose, die durch gespaltene Caspase-3-Färbung gemessen wurde. Die H&E-Färbung und immunhistologische Charakterisierung von Cytokeratin 7 in einer PDAC-Metastase der Bauchdecke zeigte, dass die abgeleiteten OTSCs keine Tumorzellen enthielten, sondern nur aus Bindegewebe bestanden, das teilweise nekrotisch war.
Jede kultivierte Scheibe kann je nach konkreter Forschungsfrage individuell profiliert werden, zum Beispiel durch RNA-Sequenzierung für die Transkriptomik oder milde Bildgebung für die ortsaufgelöste Proteomik. In Zukunft hat die Kombination mit nicht-destruktiven Analysemethoden ein großes Potenzial, um patientenspezifische Reaktionen auf verschiedene Therapieregime vorherzusagen.
