Die Nachweismethode und das durchflusszytometrische Farbschema des Japanischen Enzephalitis-Virus-spezifischen TPFS wurden getestet, um eine Referenz für ähnliche Studien zu liefern. Die Demonstration des Verfahrens wird von Linlin Zhang und Meng Zhang, zwei Studenten aus unserem Labor, durchgeführt. Zu Beginn stimulieren Sie die PBMCs der JEV-Stimulationsgruppe mit konzentrierten inaktivierten JEV-Partikeln für 16 Stunden bei 37 Grad Celsius in Gegenwart von monoklonalen Antikörpern, CD28 und CD49d, CD107a, GolgiPlug und Monensin.
Anschließend stimulieren Sie die PBMCs der Kontrollgruppe ohne konzentrierte Viruspartikel für 16 Stunden bei 37 Grad Celsius in Gegenwart von monoklonalen Antikörpern, CD28 und CD49d, CD 107a, GolgiPlug und Monensin. Sammeln Sie die Zellsuspension von jeder Gruppe in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Bei 500 g fünf Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren und den Überstand mit einer Pipette entfernen.
Resuspendieren Sie die Zellen in 1 Milliliter PBS. Fügen Sie der Zellsuspension fixierbaren Lebensfähigkeitsfarbstoff hinzu und inkubieren Sie für 10 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. Bei 500 g bei Raumtemperatur fünf Minuten zentrifugieren und den Überstand entfernen.
Nach Resuspendierung der Zellen in 1 Milliliter PBS erneut bei 500 g bei Raumtemperatur für fünf Minuten zentrifugieren und den Überstand wie zuvor demonstriert verwerfen. Um eine Zelloberflächenmarkerfärbung durchzuführen, resuspendieren Sie die Zellen in 100 Mikrolitern PBS und fügen Sie der Zellsuspension in jedem Röhrchen zwei Mikroliter jedes Oberflächenmarker-Antikörpers hinzu. Inkubieren Sie die Röhrchen für 30 Minuten bei Raumtemperatur und schützen Sie sie vor Licht.
Bei 500 g fünf Minuten zentrifugieren und den Überstand wie zuvor demonstriert entfernen. Resuspendieren Sie erneut die Zellen in einem Milliliter PBS. Bei 500 g fünf Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren und den Überstand vorsichtig verwerfen.
Um eine Fixierung und einen Membranbruch durchzuführen, resuspendieren Sie die Zellen mit 500 Mikrolitern membranbrechender Fixierlösung und fixieren Sie die Zellen für 20 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur. Dann bei 500 g für fünf Minuten zentrifugieren und den Überstand entfernen. Nach Resuspendierung der Zellen in einem Milliliter PBS fünf Minuten bei 500 g bei Raumtemperatur zentrifugieren und den Überstand vorsichtig entfernen, wie zuvor gezeigt.
Dann resuspendieren Sie die Zellen in 100 Mikrolitern PBS und fügen Sie zwei Mikroliter jedes Zytokin-Antikörpers zur Zellsuspension in jedem Röhrchen zur intrazellulären Zytokinfärbung hinzu. Inkubieren Sie die Röhrchen für 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. Zentrifugieren Sie erneut fünf Minuten lang bei 500 g und entfernen Sie den Überstand, wie zuvor gezeigt.
Resuspendieren Sie die Zellen erneut in einem Milliliter PBS. Zentrifugieren Sie bei 500 g fünf Minuten bei Raumtemperatur und entfernen Sie den Überstand vorsichtig, wie zuvor demonstriert. Dann fügen Sie 500 Mikroliter PBS hinzu, um die Zellen zu resuspendieren.
Nach der Isolierung der PBMC-Probe allein, wie zuvor gezeigt, teilen Sie die Zellsuspension in 12 gleiche Teile in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, wie im Manuskript beschrieben. In ähnlicher Weise werden nach Zugabe der Zelloberflächenmarker und des intrazellulären Zytokinantikörpers, wie zuvor gezeigt, 500 Mikroliter PBS hinzugefügt, um die Zellen und den Wirbel mit niedriger Geschwindigkeit zu resuspendieren. Passen Sie bei Verwendung einer ungefärbten Probe die Vorwärtsstreuung, die Seitenstreuung und die verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffspannungen an, während Sie die Durchflusszytometrie-Kompensation anpassen, um die Kontaminationssignale zwischen den verschiedenen Fluorophoren zu eliminieren, wobei die einzelnen Färbeproben verwendet werden.
Zeichnen Sie ein Polygongatter durch den Vorwärtsstreubereich, ein Seitenstreuflächenpunktdiagramm, um die intakte Lymphozytenpopulation auszuwählen, während Sie die Trümmer ausschließen, und ein rechteckiges Tor durch den Vorwärtsstreubereich, Vorwärtsstreubreite Punktdiagramm, um die einzelnen Zellen auszuwählen. Zeichnen Sie als Nächstes ein rechteckiges Tor durch das Punktdiagramm für den toten Seitenstreubereich, um die lebenden Zellen auszuwählen, und ein rechteckiges Tor durch das CD3-Seitenstreubereichspunktdiagramm, um die drei positiven T-Zellen der CD zu identifizieren. Zeichnen Sie dann ein Quad-Gate durch das CD4-, CD8-Punktdiagramm, um die CD4-positiven oder CD8-positiven T-Zellen zu identifizieren, und durch das CD45RO-, CD27-Punktdiagramm, um die CD4-positiven oder CD8-positiven T-Zellen in TCM und TEM zu unterteilen.
Nach dem Ziehen der Gatter von CD107a, Interferon gamma, Tumornekrosefaktor alpha, Interleukin 2 und Mikrophagen-Entzündungsprotein ein alpha aus der TCM oder TEM der CD8-positiven bzw. CD4-positiven T-Zellen, um die Häufigkeit unterschiedlicher Antwortmuster zu bestimmen. Laden Sie die Proben nacheinander auf die Zytometrie. Die Gating-Strategie wurde verwendet, um die TCM oder TEM von CD8-positiven oder CD4-positiven T-Zellen und ihre Teilmengen unter Verwendung der Vorwärtsstreubereichsbreite und dann des Seitenstreuflächenpunktdiagramms zu identifizieren.
Die polyfunktionelle Charakterisierung von CD4-positiven und CD8-positiven T-Zell-Antworten auf JEV zeigte, dass erhöhte Spiegel von CD107a, Interferon gamma, Tumornekrosefaktor alpha und Interleukin 2 in den CD8-positiven TCM-Zellen der geimpften Kinder nach JEV-Stimulation im Vergleich zu denen bei ungeimpften Kindern nachgewiesen wurden. Das Niveau des Makrophagen-Entzündungsproteins One alpha unterschied sich jedoch nicht zwischen den beiden Gruppen. Höhere Konzentrationen von CD107a und Interferon gamma wurden in den CD8-positiven TEM-Zellen der geimpften Gruppe unter JEV-Stimulation im Vergleich zur ungeimpften Gruppe nachgewiesen.
Während Tumornekrosefaktor alpha, Interleukin 2 und Makrophagen-Entzündungsprotein ein alpha, in diesen positiven Zellen nicht signifikant erhöht waren. Das JEV-Antigen induzierte erfolgreich höhere Spiegel von CD107a, Interferon gamma, Tumornekrosefaktor alpha und Makrophagen-Entzündungsprotein ein alpha in den CD4-positiven TCM-Zellen der geimpften Gruppe im Vergleich zur ungeimpften Gruppe. Der Anteil der Interleukin-2-positiven Zellen unterschied sich jedoch nicht zwischen den beiden Gruppen unter JEV-Stimulation.
Der Anteil der CD107a-positiven, Interferon-gamma-positiven und Tumornekrosefaktor-alpha-positiven Untergruppen, sub-CD4-positiven TEM-Zellen in der geimpften Gruppe war in Gegenwart von JEV höher als in der ungeimpften Gruppe. Die T-Zell-Immunogenität der Stimuli und die kompatiblen Farbabstimmungsstrategien sind kritische Schritte in diesem Protokoll.
