Name: through the looking glass: time-lapse microscopy and longitudinal tracking of single cells to study anti-cancer therapeutics
Uploaded: 2016-05-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min
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We thank Joshua Marcus for technical support and Jolien Tyler, Ph.D., Director of the Richard J. McIntosh Light Microscopy Core Facility, for technical advice. This work was supported by funds from the University of Colorado Boulder and the University of Colorado Boulder Graduate School to J.D.O. R.T.B. is partially supported by pre-doctoral training grant from the NIH (T32 GM008759). We thank Karyopharm Therapeutics, Inc. for selinexor and Merck Serono for Kinesin-5 inhibitor. FUCCI plasmids are from Atsushi Miyawaki (RIKEN, Japan) via MTA. mCherry-BP1-2 was from Addgene. HeLa expressing H2b-mCherry and &#946;-tubulin-EGFP are from Daniel Gerlich (IMBA, Austrian Academy of Sciences, Austria).

Das folgende Protokoll verwendet Parameter , die von den Experimenten definiert in den 4 und 6 zu Akquisitionseinstellungen und Versuchsbedingungen. Viele dieser Parameter können modifiziert werden , um andere Experimente zu passen (dh Belichtungszeiten, Binning, fluoreszierende Kanäle usw.). Alle Verfahren müssen den institutionellen Richtlinien und Vorschriften einhalten und von der institutionellen Biosicherheitskommission genehmigt werden. Mikroskop-Hersteller-Websites enthalten ausgezeichnete Informationen für Live Cell Imaging. 1. Mikroskope und Imaging Software <ol><li> Führen Sie Live-Cell-Imaging auf einer Vielzahl von invertierten Mikroskopen. Die am häufigsten verwendeten Mikroskope sind Epifluoreszenz und Spinnscheiben-konfokale Weitfeld-. Hier verwenden eine automatisierte und motorisierte Weitfeld- Epifluoreszenz-Mikroskop mit 200-Watt-Metall-Halogen-Lichtquelle. </li><li> Besorgen Sie sich eine Bühne-Top-oder Mikroskop Klimakammer. Hier verwenden, um eine Stufe-top Klimakammer. </li><li> Verwenden Sie kommerzielle Software zu betreiben Mikroskope mit Dienstprogramme Zeitraffer-Mikroskopie auszuführen. </li><li> Verwenden Sie handelsübliche Software oder ImageJ für die Bildanalyse. Viele andere Analysetools sind im Handel erhältlich, und es gibt maßgeschneiderte Programme von denen viele 8,18 veröffentlicht wurden. </li></ol> 2. Visualisierung zellulärer Prozesse und phänotypische Antworten <ol><li> Visualisieren Zellen mit Hellfeldmikroskopie. Differentialinterferenzkontrast und Phasenkontrast allein kann sehr informativ sein Antworten zu studieren, um Anti-Krebs-Medikament Antworten. Diese Prozesse können Mitose, Zellbeweglichkeit und Apoptose umfassen. </li><li> Visualisieren Zellstrukturen, Organellen und Prozesse mit Fluoreszenzbiosensoren. Fluoreszenzsonden sind informativ in bestimmten subzellulären Prozesse zu verfolgen. Diese können die Dynamik der Mikrotubuli sind, mitochondriale und endoplasmatischen Reticulum Dynamik, Proteinakkumulation und Lokalisierung, undMolekular Signalisierung (z. B. Phosphorylierung, Calcium). </li></ol> 3. Herstellung der Proben <ol><li> Wachsen Zellen in Zellkulturschalen in einer zertifizierten Standard befeuchteten Zellkulturbrutschrank (beispielsweise 37 ° C, 5% CO 2, 80% relative Luftfeuchtigkeit). <ol><li> Wachsen HT1080-Zellen in MEM mit EBSS. Ergänzen die Medien mit 10% v / v FBS, 1% v / v Pen / Strep, 1% v / v Natriumpyruvat und 1% v / v nicht-essentiellen Aminosäuren. </li></ol></li><li> Zwei Tage vor der Bildgebung, Platte 50.000 HT1080 Fucci Zellen in 3 Vertiefungen einer 12-Well # 1.5 Glasbodenschale in einem zertifizierten sterilen Laminar-Flow-Haube. Stellen Sie die Anzahl von Zellen ausplattiert ~ 60% Konfluenz für den Beginn des Experimentes zu erreichen. Abhängig von der Zelllinie und der Natur des Experiments kann die Zelldichte geringer sein. Anmerkung: Die Zelldichte haben großen Einfluss auf das Wachstum der Zelllinie und auf den experimentellen Ergebnissen. Zählen von Zellen zu minimieren Experiment zu Experiment variability aufgrund der Dichte. <ol><li> In Abhängigkeit von der Umgebungskammer und die notwendigen Bedingungen für das Experiment, Platte Zellen in einzelnen Well-Platten (in der Regel 35- oder 60-mm), 4 gut 35-mm-Schalen, 6-, 12- oder 24-Well-Zellkulturplatten oder Deckglas-Folien in verschiedenen Formaten. Verwenden Sie Glasbodenplatten mit # 1.5 Glas, da die meisten Objektive für diese Dicke des Glases optimiert sind, und Bildgebung durch Zellkultur-Plastik ist sehr schlecht. Hinweis: Einige Zelllinien wachsen nicht und überleben auf Glas. In diesen Fällen kann das Glas , um Anhaftung zu verbessern Zelle beschichtet werden (z. B. Poly-Lysin oder Kollagen). Einige Unternehmen stellen optische Zellkultur-Plastik, muss es empirisch ermittelt werden, ob dies ein gangbarer Weg ist. </li></ol></li></ol> 4. Umweltkammer Set-up <ol><li> Vor jedem Experimentieren, Aufbau der Klimakammer , so dass es bei ~ 80% Luftfeuchtigkeit arbeitet und so die Temperatur an der Probenposition ist 37 o C. Die meisten kultivierten Zellen wachsen in 5% CO 2 / Balance Luftatmosphäre aufgrund Natriumbicarbonat - Puffer in dem Medium. Je nach Set-up : entweder die Umgebungsregler auf 5% CO 2 , und es wird zu 100% CO 2 mit Luft mischen, oder verwenden Sie vorgemischten, zertifiziert 5% CO 2 / Balance - Luft - Gas. Folgen Sie den Herstelleranweisungen für die Gasdurchflussraten. Hinweis: Einige Zelllinien wachsen in CO 2 -unabhängigen Medium in diesem Fall können sie ohne CO 2 aufrechterhalten werden. Speziell Bildmedien ist auch, dass die Zugabe von autofluoreszenten Verbindungen begrenzt. Das Wachstum in Thesen Medien für den gewünschten Zelltyp empirisch vorher bestimmt werden. </li><li> Vor der Bildgebung gewährleistet ist, der Wasserbehälter gefüllt (nach Anweisungen des Herstellers) mit sterilem destilliertem Wasser. Schalten Sie die Klimakammer auf die gewünschte Temperatureinstellung und legen Sie sie in den Mikroskoptisch Einsatz. So speichern Sie Gas, nicht anfangen, den Fluss an dieser Stelle. Hinweis: Wenn es einen freien Raum zwischen Bühne-Top-Kammer und Bühneneinsatz und / oder jede Spannung auf Verbindungskabel an die Kammer kann es Bewegungsartefakte in das Experiment vorstellen. <ol><li> Legen Sie Stücke von Paraffinfilm über die Kanten der Bühne Einstellöffnung vor die Kammer hinein zu koppeln, um die Kammer auf die Bühne Einsetzen und stellen Sie sicher, dass keine Anschlüsse an der Kammer ziehen. </li></ol></li><li> Ermöglichen die Kammer auf 37 o C äquilibrieren Achten Sie auf eine stabile Temperatur Temperaturschwankungen während der Bildgebung zu verhindern, die die Zellphysiologie beeinflussen können und Drift einzuführen. Erreichen Temperaturausgleich erfordert typischerweise 30 min bis 1 h, je nach der Umgebung. <ol><li> Legen Sie eine &quot;Dummy&quot; Schüssel mit Wasser in den Brunnen in die Kammer unter Erwärmung. Eine Abbildungsschale mit Wasser ahmt die Probe gefüllt, die Kammer hilft sicherzustellen, dass ausreichend erwärmt und stabilisiert. Füllen der Kammer mit vorgewärmten sterilem Wasserreduziert die zur Temperaturstabilisierung erforderliche Zeit minimiert und bei der Zugabe der experimentellen Probe, die die Temperaturabnahme. </li></ol></li></ol> 5. Mikroskop Set-up <ol><li> Schalten Sie das Mikroskop, zugehörigen Computer, und alle erforderlichen Peripheriegeräte. <ol><li> In Abhängigkeit von der Lichtquelle, warten , um ihn einzuschalten , bis sie benötigt (z. B. LED). </li></ol></li><li> Mit dem Objektivrevolver in einer niedrigen Position, wählen Sie die 20X 0,7 NA-Objektiv verwendet werden. </li><li> Positionieren Sie die Probe auf das Ziel - das macht es einfacher, die Zellen zu finden, wenn die Probe in der Kammer ist. </li><li> Definieren Abbildungsparameter in dieser Zeit, wenn sie von früheren Experimenten bekannt sind. </li></ol> 6. Der Transport von Zellen an ein Mikroskop und in die Kammer <ol><li> Transportieren Sie die Zellen aus dem Inkubator in die Klimakammer abgebildet werden. Stellen Sie sicher , dass dies schnell getan wird , um die Auswirkungen einer vergleichsweise niedrigen CO 2 zu begrenzen , </sub&gt; Atmosphäre und verringerte Temperatur auf die Zellen. Folgen Sie alle institutionellen Biosicherheit Richtlinien für die Probentransport und clean-up im Falle eines Austretens. <ol><li> Legen Sie die Zellen in einem verschlossenen Behälter Styropor oder isolierte Tasche große Veränderungen der Umwelt zu vermeiden. </li></ol></li><li> Legen Sie die Probenabbildung Schale in die Kammer Anweisungen des folgenden Herstellers. </li><li> Nachdem die Zellen innerhalb der Klimakammer, dichten die Kammer zu halten, ein stabiles Umfeld und gleich wieder auf die Quelle (n) des atmosphärischen Gas gesichert wurden. <ol><li> Da einige Klimakammern, keine engen, versiegelte Deckel nutzen zu verzögern Verdunstung, Schicht steril, Embryo-zertifizierte Mineralöl auf der Oberseite des Wachstumsmediums. Gas-permeant Paraffinfilm Wickeln um den Umfang Kanten der Probenschale vorsichtig das Glas nicht Imaging-Bereich zu behindern. Lokalisierte können sekundäre Befeuchtung Verfahren eingesetzt werden. Kondensation auf dem Deckel der Probenschale kann perfor verringernmance von Hellfeldmikroskopie. </li></ol></li><li> Um die Auswirkungen der thermischen Drift früh während des Experiments zu minimieren, warten, 30 Minuten vor der Zeitraffer beginnen. Die benötigte Zeit hängt von Imaging-Schüssel Größe und andere Faktoren. Bestimmen Sie empirisch. </li></ol> 7. Einstellen der Imaging up <ol><li> Wählen Sie Abbildungsbedingungen, die am besten die Daten darstellen. Treffen Sie Vorkehrungen Phototoxizität zu vermeiden, indem Belichtungszeiten zu begrenzen, mit geringerer Intensität Licht und Auswahl von Sonden, die durch längere Wellenlängen des Lichts angeregt werden. </li><li> Definieren x, y und z-Ebene und der gewünschten Wellenlänge (n) für jede Position abgebildet werden. Die Zeitauflösung ist durch die Anzahl von Positionen und Wellenlängen beschränkt. Für langfristige Zeitraffer der meisten zellulären Prozesse, erwerben ein Bild alle 10 - 20 min; höhere Zeitauflösung (kurzen Intervallen, z. B. 1 min) mehr Datenpunkte liefert und damit robuster Zellverfolgung, sondern führt auch zu stärker integriertenBelichtung und größere Datenmengen. <ol><li> Als HT1080 Fucci dynamische grün und rot fluoreszierende Proteine ​​(Repräsentative Ergebnisse sehen), verwenden Sie die folgenden Belichtungszeiten: FITC / GFP - 50 ms, Texas Rot / TRITC - 40 ms, Hellfeld - 20 ms. Verwenden Sie ein 2 x 2 bin. </li></ol></li><li> Aktivieren Software gesteuert automatische Scharfeinstellung die Standardparameter in den erweiterten Einstellungen. Definieren Sie ein Autofokus-Bereich von 10 &amp; mgr; m mit der empfohlenen Schrittgröße. Achten Sie darauf, dies zu tun, bevor die Zeitraffer beginnen. Autofokus mit Hell- Bilder und nie mit Fluoreszenzphototoxizität und Photobleaching zu reduzieren. <ol><li> Softwaregesteuerte Systeme Autofokus auf jedem Mikroskop mit einem motorisierten Tisch und direkt konzentrieren sich auf die Probe. Sie können jedoch die Erfassungsgeschwindigkeit des Experiments begrenzen. Hardware gesteuert Dauerfokussierart Systeme funktionieren gut für Zeitraffer-Mikroskopie und Geschwindigkeit zu verbessern, für mehr Positionen ermöglicht abgebildet oder eine höhere Rate des Erwerbs werden. Aber siestützen sich auf Detektion der Grenzfläche Luft-Glas und kann Mittelpunkt der Probe mit Variationen in der Glasdicke über die gut verlieren. </li></ol></li><li> Ersetzen Sie die Hälfte der Medien mit Medien die gewünschte Wirkstoffkonzentration enthält , die auf 37 ° C erwärmt wurde Teil Medien Austausch hilft thermische Drift zu reduzieren. Die Bedingungen, die in diesem Experiment sind Vehikel (DMSO), 1 &amp; mgr; M selinexor und 10 uM PD0332991. Anmerkung: Dieser Schritt kann auch durch Anhalten und Neustarten des Experimentes nach dem Start der Übernahme erfolgen. Dies ermöglicht eine Längs Verfolgung von Pre- und Post-drug-Antworten einzelner Zellen. Wenn der Arzneimittelstabilität oder Stoffwechsel ist ein Anliegen, Pausieren und ersetzt die Medien können mit dem gleichen Verfahren durchgeführt werden. Um zu testen, für die Arzneimittel Abbau oder Metabolismus, Medien von behandelten Zellen können auch auf naive Zellen platziert werden Arzneimittelwirkung zu testen. </li><li> Starten Sie den Zeitraffer. </li><li> Da die Zeitraffer läuft, stellen Sie sicher, dass die abgebildeten Felder im Fokus bleiben und die chamber hält ein feuchtes 37 o C. <ol><li> Stellen Sie den Fokus, wie durch Anhalten der Erwerb während der Zeitabstand zwischen den Zeitpunkten benötigt. </li></ol></li><li> Falls erforderlich, fügen Sie Wasser in die Kammer bei längeren Experimenten. Vermeiden Sie die Kühlkammer durch Zugabe von vorgewärmten, steriles destilliertes Wasser bei 37 ° C </li></ol> 8. Beenden der Time-lapse <ol><li> Wenn das Experiment zu Ende ausgeführt wurde, beenden Sie den Erwerb, wenn es nicht automatisch zu stoppen, wurde eingestellt. </li><li> Stellen Sie sicher, dass die Zeitraffer richtig auf der Festplatte gespeichert wurde, obwohl die meisten Softwarepakete automatisch während der Aufnahme zu speichern, wenn nicht ordnungsgemäß Daten fertig verloren gehen kann. </li><li> Entfernen Sie die Kammer aus dem Mikroskop und entsorgen Sie die Zellen in biologisch gefährlichen Abfall folgende zugelassene institutionelle Biosicherheit Verfahren. </li></ol> 9. Longitudinal-Tracking und Analyse von Zeitraffer-Daten <ol><li> Wählen Sie die Methode für die Analyse, die istGeeignet für die biologischen Prozesse von Interesse. Viele Plugins für ImageJ, Programme mit Matlab und benutzerdefinierte Plattformen wurden für spezifische Anwendungen hergestellt. Die folgende Methodik umfasst Tracking von Kernen und Analyse von Kernfluoreszenzsonden , wie in den 4 und 5 gezeigt. </li><li> Öffnen Sie die .tif Bildstapel für die verwendeten Kanäle in ImageJ. Alternativ öffnen Sie native Dateien aus dem Erwerb Programm direkt in ImageJ das Bioformats Plugin. </li><li> Zeichnen Sie eine Region of Interest (ROI) innerhalb des Kerns einer Zelle die Hell- Bild oder das Kernetikettenkanal verwendet (falls verwendet), und fügen Sie den ROI-Manager. Hinweis: Wenn die abgebildeten Zellen , die ein Kern Etikett (zB Histone H2B-EGFP.), Dann wird die automatische Zellverfolgung genutzt werden können Regionen von Interesse (ROIs) , die einzelnen Kerne durch die Zeit zu erstellen. </li><li> Fahren Sie mit dem nächsten Punkt und positionieren Sie den ROI innerhalb des gleichen nucleus. Fügen Sie den ROI zu dem ROI-Manager. </li><li> Weiter zu verfolgen und zu machen ROIs für die einzelne Zelle , bis eine Zellereignis ist (Mitose, Apoptose, etc.) , Oder die Zelle nicht mehr nachgeführt werden kann (dh., Bewegt sich aus dem Rahmen oder der Versuch beendet). </li><li> Wenn ROIs sind für Zellen durch die Zeit, die sie im Feld sind, überlagern sie auf die Fluoreszenzkanäle von Interesse etabliert. Messen Sie die mittlere Intensität der Fluoreszenz in jedem Kanal für jeden Zeitpunkt. Speichern Sie die ROI-Liste für die spätere Verwendung. <ol><li> Verschiedene Messungen können innerhalb der ROI für Anwendungen in verschiedenen Experimenten durchgeführt werden. Klicken Sie Analyse → Set Messungen ... ein Menü zu öffnen , um die Analysemethode wählen (z. B. mittlere Intensität innerhalb des ROI, integrierte Intensität, etc.). </li></ol></li><li> Hinweis Zellschicksale für einzelne Zellen (z. B. Apoptose, Teilung, Überleben) , während Tracking. Dies ermöglicht die Schaffung von Überlebenskurven und further Populationsanalyse. </li><li> Mit der mittleren Intensität für beide Kanäle, erstellen Sie ein Streudiagramm zu Zellzyklusdynamik in Reaktion auf Therapeutika (5B, C) ​​anzuzeigen. Hinweis: Die Grundstücke können für einzelne Zellen im Laufe der Zeit oder gemittelt über eine Population von Zellen verfolgt erstellt werden. Quantitative Bildgebung kann für den Aufbau komplexer Reaktionen und Zell Beziehungen in Reaktion auf Krebstherapeutika kritisch sein. Langzeit Zeitraffer-Mikroskopie, Längsverfolgung und Datenanalyse ist ein mehrstufiger Prozess, mit vielen Optionen für die Art der Mikroskopie und Analyse - Tools, und folgt dem allgemeinen Umriss versehen in Abbildung 1. </li></ol>

The authors have no conflicts of interest to disclose.

Vorteile der Zeitraffermikroskopie und Longitudinal - Tracking Das Mikroskop ist ein ideales Instrument für Langzeitstudien von Arzneimittelreaktion, wie sie Forscher können einzelne Zellen und ihre Schicksale sowie die gesamte Bevölkerung zu verfolgen. Variability in Ansprechen auf das Medikament innerhalb einer Population von Zellen ist ein wichtiges Thema für Anti-Krebs-Therapie-Design. Längs-Tracking einzelner Zellen ermöglicht Ermittler diese Vari...

Live-Zell-Mikroskopie und Längsverfolgung einzelner Zellen ist keine neue Technik. Von den frühesten Mikroskope haben Enthusiasten und Wissenschaftler beobachteten , und einzelne Zellen und Organismen untersucht, ihr Verhalten und die Entwicklung 1-3. Ein berühmtes Beispiel aus dem späten David Rogers an der Vanderbilt University in den 1950er Jahren zeigt eine menschliche Neutrophilen in einem Blutausstrich ein Bakterium Staphylococcus aureus und schließlich den Prozess der Phagozytose 4 jagen. Diese Live-cell-Film ist ein ausgezeichnetes Beispiel dafür, wie mehrere Prozesse können in einem einzigen Experiment beobachtet und korreliert werden: Erfassen eines chemischen Gradienten, der Mechanik und der Geschwindigkeit der Zellbewegung, Zellformen Dynamik, Adhäsion und Phagozytose eines Pathogens. Das Aufkommen der vollautomatischen Mikroskope und hochempfindliche Digitalkameras hat sich in einer wachsenden Zahl von Ermittlern führte Mikroskopie grundlegende Fragen in der Zellbiologie bis hin f fragen mitrom , wie Zellen 5,6 und 7,8 dividieren zu Organell Dynamik und Membrantransport 11.09 bewegen. Nicht fluoreszierende, Hellfeldmikroskopie, einschließlich Phasenkontrast (PC), die den Nobelpreis für Frits Zernike 1953 sammelte und Differentialinterferenzkontrast (DIC) für die Beobachtung von Zellen und Zellkerne erlauben, sondern auch subzellulärer Strukturen einschließlich Mikrotubulus-Bundles , Chromosomen, Kernkörperchen, Organell Dynamik und dicke Aktinfasern 12. Genetisch kodierte fluoreszierende Proteine ​​und die Entwicklung von Fluoreszenzfarbstoffen gegen Organellen haben sich dramatisch Zeitraffer-Mikroskopie 13-15 beeinflusst. Zwar nicht der Schwerpunkt dieses Artikels, Bildgebung in der Zelle Sphäroiden und in situ (Intravitalmikroskopie) mit Hilfe einer konfokalen und Multiphotonen - Mikroskopie stellen eine weitere Ausweitung des Ansatzes, und es gibt hervorragende Artikel , die diese Ansätze 16-19 verwenden und zu diskutieren. Die Antworten von Zellen auf Anti-cancer Drogen oder natürliche Produkte werden auf der molekularen und zellulären Skala bestimmt. Verständnis Zellantworten und Schicksal nach der Behandlung beinhaltet häufig Population Lungs Assays (z. B. Immunoblotting, ganz gut Maßnahmen) oder festen Zeitpunkten mit Immunofluoreszenz - Nachweis und Durchflusszytometrie, die einzelnen Zellen zu messen. Heterogeneity in Einzelzellreaktionen auf Arzneimittel innerhalb einer Population, insbesondere in Tumoren, können einige der Variabilität in Reaktion auf Zelllinien und Tumoren gesehen erklären, die mit dem gleichen Medikament bei Sättigung behandelt. Langzeitlängs Ansätze einer gegebenen einzelnen Zelle oder einer Population von Zellen zu folgen ist ein seltener , aber sehr leistungsfähigen Ansatz, der für die direkte Untersuchung der molekularen Reaktionswege, verschiedene Phänotypen (z. B. den Zelltod oder die Zellteilung) ermöglicht es , die Beobachtung von Zell-zu-Zell - Variabilität innerhalb einer Population, und wie diese Faktoren tragen zur Bevölkerung Ansprechdynamik 20-22. Optimistisch, in der Lage zu seinzu beobachten und einzelne Zell-Reaktionen zu quantifizieren wird unser Verständnis von zu verbessern, wie Medikamente wirken, warum sie manchmal scheitern, und wie man sie am besten nutzen. Die Technik der langfristigen Zeitraffer-Mikroskopie, Längs - Tracking und Analyse von Arzneimittelreaktionen zu vielen Forschern zur Verfügung und kann einfach sein, nur im Durchlicht - Phänotyp Antworten 20,21 zu beobachten. Die Hauptkomponenten des Ansatzes sind: eine angemessene Vorbereitung der Zellen von Interesse, ein automatisiertes Mikroskop mit Klimakammer, eine Kamera mit einem Computer integriert, um die Bilder zu erfassen und zu speichern, und Software, die im Zeitraffer und zu messen und zu analysieren, um die Zellen zu überprüfen und alle Fluoreszenzbiosensoren. Wir bieten ein detailliertes Protokoll mit vielen Tipps für die Durchführung von Zeitraffer-Mikroskopie von kultivierten Zellen so lange wie mehrere Tage mit Hell- und / oder Weitfeld Epifluoreszenzmikroskopie. Dieses Protokoll kann für jede Zelllinie verwendet werden, die in Kultur gezüchtet werden können,ihre Reaktionen auf Anti-Krebs-Therapien zu untersuchen. Wir stellen Beispiele von Daten erfasst und unter Verwendung mehrerer verschiedener genetisch kodierten Fluoreszenz Biosensoren und ein Beispiel für Phasenkontrast-Mikroskopie, kurz verschiedene Arten von Sonden, die Vor- und Nachteile der langfristigen Zeitraffer und Längs Tracking diskutieren, was sein kann für diesen Ansatz gelernt, die aus nicht-direkten Ansätze zu verstehen, und einige Variationen, die wir hoffen, dass sein Interesse und Wert für unerfahrene Forscher, die nicht als mit dem Ansatz, und erfahrene Forscher schwierig ist.

<table><tbody><tr><td>Taxol (paclitaxel)</td><td>Sigma</td><td>T7191</td><td>microtubule stabilizing drug</td></tr><tr><td>Etoposide</td><td>Selleckchem</td><td>S1225</td><td>topoisomerase II inhibitor</td></tr><tr><td>Selinexor</td><td>Karyopharm Therapeutics</td><td>na</td><td>XPO1/CRM1 inhibitor, gift</td></tr><tr><td>Kinesin-5 inhibitor</td><td>Merck Serono</td><td>na</td><td>gift, also available from American Custom Chemicals Corporation. CAS 858668-07-2</td></tr><tr><td>Cell growth medium</td><td>HyClone (Fisher) or Mediatech</td><td></td><td>many companies available</td></tr><tr><td>5% CO2/balance air, certified</td><td>Airgas</td><td>Z03NI7222004379</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Dish, 20 mm glass bottom</td><td>Cellvis</td><td>D35-20-1.5-N</td><td>many companies available</td></tr><tr><td>35 mm 4-well Dish, 20 mm glass bottom</td><td>Cellvis</td><td>D35C4-20-1.5-N</td><td>many companies available</td></tr><tr><td>35 mm Dish, gridded glass bottom</td><td>MatTek</td><td>P35G-2-14-CGRD</td><td>many companies available</td></tr><tr><td>Multi-well, glass bottom</td><td>Cellvis</td><td>P12-1.5H-N</td><td>many companies available</td></tr><tr><td>Olympus IX81 inverted epifluorescence microscope</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX2-UCB controller</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PRIOR LumenPro200</td><td>Prior Scientific</td><td>Lumen200PRO</td><td></td></tr><tr><td>PRIOR Proscan III motorized stage</td><td>Prio Scientific</td><td>H117</td><td></td></tr><tr><td>STEV chamber</td><td>InVivo Scientific</td><td>STEV.ECU.HC5 STAGE TOP</td><td></td></tr><tr><td>Environmental Controller Unit</td><td>InVivo Scientific</td><td>STEV.ECU.HC5 STAGE TOP</td><td></td></tr><tr><td>Hamamatsu ORCA R2 CCD with controller</td><td>Hamamatsu</td><td>C10600</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon laser launch</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SOLA light engine</td><td>lumencor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iXon Ultra 897 EM-CCD</td><td>ANDOR&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TOKAI HIT inclubation chamber</td><td>TOKAI HIT</td><td>TIZSH</td><td></td></tr></tbody></table>

through the looking glass: time-lapse microscopy and longitudinal tracking of single cells to study anti-cancer therapeutics

Die Reaktion von einzelnen Zellen auf Anti-Krebs-Medikamente trägt wesentlich die Bevölkerung Antwort bei der Bestimmung, und ist daher ein wichtiger Faktor in dem Gesamtergebnis. Immunoblotting, die Durchflusszytometrie und fixierte Zellexperimente werden oft verwendet, zu untersuchen, wie Zellen auf Anti-Krebs-Medikamente reagieren. Diese Verfahren sind wichtig, aber sie haben verschiedene Nachteile. Variability in der Arzneimittelreaktionen zwischen Krebszellen und normalen Zellen und zwischen Zellen verschiedener Krebs Ursprungs und transiente und seltene Reaktionen sind schwierig mit Bevölkerung Lungs Assays zu verstehen und ohne direkt in der Lage zu verfolgen und sie in Längsrichtung zu analysieren. Das Mikroskop ist besonders gut geeignet, um Bild lebenden Zellen. Fortschritte in der Technologie ermöglichen es uns, bei einer Auflösung routinemäßig Zellen Bild, das nicht nur Zellverfolgung ermöglicht, sondern auch die Beobachtung einer Vielzahl von zellulären Reaktionen. Wir beschreiben einen Ansatz im Detail, die für die kontinuierliche Zeitraffer-Bildgebung ermöglicht es derZellen während der Arzneimittelantwort für im wesentlichen so lange wie gewünscht, in der Regel bis zu 96 Stunden. Mit Variationen des Ansatzes können die Zellen für Wochen überwacht werden. Mit dem Einsatz von genetisch Fluoreszenzbiosensoren codiert zahlreiche Prozesse, Wege und Reaktionen können verfolgt werden. Wir zeigen Beispiele, die Verfolgung und die Quantifizierung von Zellwachstum und die Zellzyklusprogression, Chromosomendynamik, DNA-Schädigung und Zelltod sind. Wir diskutieren auch Variationen der Technik und ihrer Flexibilität und typische Fehler hervorzuheben.

Langzeit Zeitraffer-Mikroskopie und direkte Längs Tracking ermöglicht die Untersuchung von vielen Anti-Krebs-Wirkung während der Arzneimittelantwort. Nach dem allgemeinen Umriß in Figur 1, werden mehrere Beispiele für Zellen gezeigt validierten fluoreszierenden Reporter exprimieren , das mit Anti-Krebs - Medikamenten behandelt, verfolgt und analysiert werden verschiedene Ansätze verwendet. Phasenkontrast...

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Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopy and Longitudinal Tracking of Single Cells to Study Anti-cancer Therapeutics

Here, we describe a method of long-term time-lapse microscopy to longitudinally track single cells in response to anti-cancer therapeutics.

Durch den Spiegel: Zeitraffer-Mikroskopie und Longitudinal-Tracking von Einzelzellen Anti-Krebs-Therapeutika zu studieren

The response of single cells to anti-cancer drugs contributes significantly in determining the population response, and therefore is a major contributing ...

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A Time-lapse, Label-free, Quantitative Phase Imaging Study of Dormant and Active Human Cancer Cells

The acquisition of the angiogenic phenotype is an essential component of the escape from tumor dormancy. Although several classic in vitro assays (e.g., proliferation, migration, and others) and in vivo models have been developed to investigate and characterize angiogenic and non-angiogenic cell phenotypes, these methods are time and labor intensive, and often require expensive reagents and instruments, as well as significant expertise. In a recent study, we used a novel quantitative phase imaging (QPI) technique to conduct time-lapse and labeling-free characterizations of angiogenic and non-angiogenic human osteosarcoma KHOS cells. A panel of cellular parameters, including cell morphology, proliferation, and motility, were quantitatively measured and analyzed using QPI. This novel and quantitative approach provides the opportunity to continuously and non-invasively study relevant cellular processes, behaviors, and characteristics of cancer cells and other cell types in a simple and integrated manner. This report describes our experimental protocol, including cell preparation, QPI acquisition, and data analysis.

Dormant and active cancer cell phenotypes were characterized using quantitative phase imaging. Cell proliferation, migration, and morphology assays were integrated and analyzed in one simple method.

Ein Time-Lapse, markierungsfreie, Quantitative Phase bildgebende Untersuchung der ruhenden und aktiven menschlichen Krebszellen

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Forschung

Krebsforschung

Long-term Live-cell Imaging to Assess Cell Fate in Response to Paclitaxel

Live-cell imaging is a powerful technique that can be used to directly visualize biological phenomena in single cells over extended periods of time. Over the past decade, new and innovative technologies have greatly enhanced the practicality of live-cell imaging. Cells can now be kept in focus and continuously imaged over several days while maintained under 37 &#176;C and 5% CO2 cell culture conditions. Moreover, multiple fields of view representing different experimental conditions can be acquired simultaneously, thus providing high-throughput experimental data. Live-cell imaging provides a significant advantage over fixed-cell imaging by allowing for the direct visualization and temporal quantitation of dynamic cellular events. Live-cell imaging can also identify variation in the behavior of single cells that would otherwise have been missed using population-based assays. Here, we describe live-cell imaging protocols to assess cell fate decisions following treatment with the anti-mitotic drug paclitaxel. We demonstrate methods to visualize whether mitotically arrested cells die directly from mitosis or slip back into interphase. We also describe how the fluorescent ubiquitination-based cell cycle indicator (FUCCI) system can be used to assess the fraction of interphase cells born from mitotic slippage that are capable of re-entering the cell cycle. Finally, we describe a live-cell imaging method to identify nuclear envelope rupture events.

Live-cell imaging provides a wealth of information on single cells or whole populations that is unattainable by fixed cell imaging alone. Here, live-cell imaging protocols to assess cell fate decisions following treatment with the anti-mitotic drug paclitaxel are described.

Langfristige Leben-Cell Imaging zu Zelle Schicksal als Reaktion auf Paclitaxel bewerten

Live-cell imaging is a powerful technique that can be used to directly visualize biological phenomena in single cells over extended periods of time. Over ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized treatment determination. However, perturbation of the tumor architecture by biopsy and other invasive procedures has been associated with undesired effects on tumor progression, which need to be studied in depth to further improve the clinical benefit of these procedures. Conventional static approaches, which only provide a snapshot of the tumor, are limited in their ability to reveal the impact of biopsy on tumor cell behavior such as migration, a process closely related to tumor malignancy. In particular, tumor cell migration is the key in highly aggressive brain tumors, where local tumor dissemination makes total tumor resection virtually impossible. The development of multiphoton imaging and chronic imaging windows allows scientists to study this dynamic process in living animals over time. Here, we describe a method for the high-resolution longitudinal imaging of brain tumor cells before and after a biopsy in the same living animal. This approach makes it possible to study the impact of this procedure on tumor cell behavior (migration, invasion, and proliferation). Furthermore, we discuss the advantages and limitations of this technique, as well as the ability of this methodology to study changes in the cancer cell behavior for other surgical interventions, including tumor resection or the implantation of chemotherapy wafers.

Here we describe a method for high-resolution time-lapse multiphoton imaging of brain tumor cells before and after invasive surgical intervention (e.g., biopsy) within the same living animal. This method allows studying the impact of these invasive surgical procedures on tumor cells&#39; migratory, invasive, and proliferative behavior at a single cell level.

Längsschnitt-Intravital-Bildgebung des Hirntumorzellverhaltens als Reaktion auf eine invasive chirurgische Biopsie

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Time-Lapse 2D Imaging of Phagocytic Activity in M1 Macrophage-4T1 Mouse Mammary Carcinoma Cells in Co-cultures

Tumor-associated macrophages (TAMs) have been identified as an important component for tumor growth, invasion, metastasis, and resistance to cancer therapies. However, tumor-associated macrophages can be harmful to the tumor depending on the tumor microenvironment and can reversibly alter their phenotypic characteristics by either antagonizing the cytotoxic activity of immune cells or enhancing anti-tumor response. The molecular actions of macrophages and their interactions with tumor cells (e.g., phagocytosis) have not been extensively studied. Therefore, the interaction between immune cells (M1/M2-subtype TAM) and cancer cells in the tumor microenvironment is now a focus of cancer immunotherapy research. In the present study, a live cell coculture model of induced M1 macrophages and mouse mammary 4T1 carcinoma cells was developed to assess the phagocytic activity of macrophages using a time-lapse video feature using phase-contrast, fluorescent, and differential interference contrast (DIC) microscopy. The present method can observe and document multipoint live-cell imaging of phagocytosis. Phagocytosis of 4T1 cells by M1 macrophages can be observed using fluorescent microscopy before staining 4T1 cells with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE). The current publication describes how to coculture macrophages and tumor cells in a single imaging dish, polarize M1 macrophages, and record multipoint events of macrophages engulfing 4T1 cells during 13 h of coculture.

Macrophage phagocytic activity against cancer cells, specifically 4T1 mouse mammary carcinoma cells, was imaged in this study. The live cell coculture model was established and observed using a combination of fluorescent and differential interference contrast microscopy. This assessment was imaged using imaging software to develop multipoint time-lapse video.

Time-Lapse 2D Imaging der phagozytischen Aktivität in M1 Macrophage-4T1 Maus-Mammary Karzinom-Zellen in Kokulturen

Tumor-associated macrophages (TAMs) have been identified as an important component for tumor growth, invasion, metastasis, and resistance to cancer ...

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional co-culture systems are frequently used to explicate tumor-stroma interactions, including their role in drug responses. However, many of the interactions that occur in vivo in the intact microenvironment cannot be completely replicated in these in vitro settings. Thus, direct visualization of these processes in real-time has become an important tool in understanding tumor responses to therapies and identifying the interactions between cancer cells and the stroma that can influence these responses. Here we provide a method for using spinning disk confocal microscopy of live, anesthetized mice to directly observe drug distribution, cancer cell responses and changes in tumor-stroma interactions following administration of systemic therapy in breast cancer models. We describe procedures for labeling different tumor components, treatment of animals for observing therapeutic responses, and the surgical procedure for exposing tumor tissues for imaging up to 40 hours. The results obtained from this protocol are time-lapse movies, in which such processes as drug infiltration, cancer cell death and stromal cell migration can be evaluated using image analysis software.

We describe a method for imaging response to anti-cancer treatment in vivo and at single cell resolution.

Live-Imaging of Drug Responses in der Tumor-Mikroumgebung in Mausmodellen von Brustkrebs

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

Medizin

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from different genetically engineered mouse models of breast cancer. For example, time between cell divisions (cell lifetimes), apoptotic cell numbers, evolution of morphological changes, and mechanism of colony formation can be quantified and compared in cells carrying specific genetic lesions. Primary mammary epithelial cell cultures are generated from mammary glands without palpable tumor. Glands are carefully resected with clear separation from adjacent muscle, lymph nodes are removed, and single-cell suspensions of enriched mammary epithelial cells are generated by mincing mammary tissue followed by enzymatic dissociation and filtration. Single-cell suspensions are plated and placed directly under a microscope within an incubator chamber for live-cell imaging. Sixteen 650 &mu;m x 700 &mu;m fields in a 4x4 configuration from each well of a 6-well plate are imaged every 15 min for 5 days. Time-lapse images are examined directly to measure cellular behaviors that can include mechanism and frequency of cell colony formation within the first 24 hr of plating the cells (aggregation versus cell proliferation), incidence of apoptosis, and phasing of morphological changes. Single-cell tracking is used to generate cell fate maps for measurement of individual cell lifetimes and investigation of cell division patterns. Quantitative data are statistically analyzed to assess for significant differences in behavior correlated with specific genetic lesions.

Time-lapse imaging is used to assess behavior of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer risk to determine if there are correlations between specific behavioral parameters and distinct genetic lesions.

Zeitraffer-Imaging of Primary Präkanzeröse Brustepithelzellen aus gentechnisch veränderten Mausmodellen der Breast Cancer Abgeleitet

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Zeitraffer-Imaging der Mitose Nach siRNA-Transfektion

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Biologie

Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and metastasis. Multicellular interactions in the tumor microenvironment can lead to transient events including directional tumor cell motility and vascular permeability. Quantification of tumor vascular permeability has frequently used end-point experiments to measure extravasation of vascular dyes. However, due to the transient nature of multicellular interactions and vascular permeability, the kinetics of these dynamic events cannot be discerned. By labeling cells and vasculature with injectable dyes or fluorescent proteins, high-resolution time-lapse intravital microscopy has allowed the direct, real-time visualization of transient events in the tumor microenvironment. Here we describe a method for using multiphoton microscopy to perform extended intravital imaging in live mice to directly visualize multicellular dynamics in the tumor microenvironment. This method details cellular labeling strategies, the surgical preparation of a mammary skin flap, the administration of injectable dyes or proteins by tail vein catheter and the acquisition of time-lapse images. The time-lapse sequences obtained from this method facilitate the visualization and quantitation of the kinetics of cellular events of motility and vascular permeability in the tumor microenvironment.

This protocol describes the use of multiphoton microscopy to perform extended time-lapse imaging of multicellular interactions in real time, in vivo at single cell resolution.

Erweiterte Zeitraffer-Intravital Imaging von Echtzeit-Vielzellige Dynamics im Tumormikromilieu

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and ...

Live Imaging Followed by Single Cell Tracking to Monitor Cell Biology and the Lineage Progression of Multiple Neural Populations

Understanding the mechanisms that control critical biological events of neural cell populations, such as proliferation, differentiation, or cell fate decisions, will be crucial to design therapeutic strategies for many diseases affecting the nervous system. Current methods to track cell populations rely on their final outcomes in still images and they generally fail to provide sufficient temporal resolution to identify behavioral features in single cells. Moreover, variations in cell death, behavioral heterogeneity within a cell population, dilution, spreading, or the low efficiency of the markers used to analyze cells are all important handicaps that will lead to incomplete or incorrect read-outs of the results. Conversely, performing live imaging and single cell tracking under appropriate conditions represents a powerful tool to monitor each of these events. Here, a time-lapse video-microscopy protocol, followed by post-processing, is described to track neural populations with single cell resolution, employing specific software. The methods described enable researchers to address essential questions regarding the cell biology and lineage progression of distinct neural populations.

A robust protocol to monitor neural populations by time-lapse video-microscopy followed by software-based post-processing is described. This method represents a powerful tool to identify biological events in a selected population during live imaging experiments.

Leben Sie Imaging, gefolgt von einzelligen Tracking Monitor Zellbiologie und die Linie Fortschreiten der mehrere neuronalen Populationen

Understanding the mechanisms that control critical biological events of neural cell populations, such as proliferation, differentiation, or cell fate ...

Neurowissenschaften

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

Conventional imaging techniques can provide detailed information about cellular processes. However, this information is based on static images in an otherwise dynamic system, and successive phases are easily overlooked or misinterpreted. Live-cell imaging and time-lapse microscopy, in which living cells can be followed for hours or even days in a more or less continuous fashion, are therefore very informative. The protocol described here allows for the investigation of the fate of chemotherapeutic nanoparticles after the delivery of doxorubicin (dox) in living cells. Dox is an intercalating agent that must be released from its nanocarrier to become biologically active. In spite of its clinical registration for more than two decades, its uptake, breakdown, and drug release are still not fully understood. This article explores the hypothesis that lipid-based nanoparticles are taken up by the tumor cells and are slowly degraded. Released dox is then translocated to the nucleus. To prevent fixation artifacts, live-cell imaging and time-lapse microscopy, described in this experimental procedure, can be applied.

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

Live-cell imaging is a powerful tool to visualize dynamic processes. The examination of fixed cells provides only static pictures, which can lead to misinterpretation and confusion about the process. This work presents a method to study uptake, drug release, and intracellular localization of liposomal nanoparticles in living cells.

Verwendung von In-vitro- Live Cell Imaging zur Erkundung Chemotherapeutika geliefert durch Lipid-basierte Nanopartikel

Conventional imaging techniques can provide detailed information about cellular processes. However, this information is based on static images in an ...