Die Autorinnen danken allen Frauen, die zugestimmt und Proben für diese Studie gespendet haben.

Der Forschungsinhalt und das Protokoll wurden von der Forschungsethikkommission des Shenzhen Zhongshan Urology Hospital ethisch geprüft und genehmigt. Alle Frauen (20 bis 40 Jahre), die an der Studie teilnahmen, gaben eine informierte Einwilligung für die Probenentnahme und -verwendung.
1. Gewinnung von pathologischem Gewebe
<ol><li>Bereiten Sie die Werkzeuge für die Gewebeentnahme vor, nämlich Messlineal, Pinzette, Einbettkassette, Einbettpapier und Taschentuchkorb.</li>
	<li>Beobachten Sie, ob die Menge an Endometriumgewebe (größer als eine Mungobohne), die mit einem Standardansatz mit einem Pipellenkatheter entnommen wird, ausreichend ist.</li>
	<li>Übertragen Sie das Endometriumgewebe von Formalin mit einer Pinzette auf das Einbettpapier und messen Sie die Abmessungen des Endometriumgewebes mit einem Lineal.</li>
	<li>Wickeln Sie das Endometriumgewebe mit Einbettpapier ein und legen Sie es in eine Einbettkassette.</li>
	<li>Legen Sie die Einbettkassette zur Dehydrierung in den Taschentuchkorb.</li>
</ol>2. Austrocknung des Gewebes
<ol><li>Stellen Sie den Gewebekorb in die Reaktionskammer des Dörrgeräts (siehe Materialtabelle) und starten Sie das Verfahren zur routinemäßigen Gewebedehydrierung: Formalin für 100 Minuten; Formalin für 100 min; 75% Alkohol für 60 min; 85% Alkohol für 60 min; 95% Alkohol für 60 min; 100% Alkohol für 60 min; 100% Alkohol für 60 min; 100% Alkohol für 60 min; Xylol für 35 min; Xylol für 20 min; Xylol für 20 min; Wachs für 80 min; Wachs für 80 min; 80 Min. wachs lassen. Der Vorgang dauert ca. 15 h.</li>
	<li>Öffnen Sie am Ende der Gewebetrocknung die Reaktionskammer des Dörrgeräts und entfernen Sie den Gewebekorb.</li>
</ol>3. Einbettung von Gewebe
<ol><li>Nehmen Sie eine geeignete Einbettform entsprechend der Größe der Probe heraus und füllen Sie sie bei 70 °C mit Paraffinwachs.</li>
	<li>Legen Sie das Gewebe schnell in die Form und stellen Sie es vorsichtig so ein, dass sich das Gewebe in der Mitte der Form befindet.</li>
	<li>Bewegen Sie die Form sanft auf die Kühlplatte und drücken Sie das Gewebe vorsichtig an, während das Paraffin am Boden aushärtet.</li>
	<li>Legen Sie die Einbettkassette auf die Form und füllen Sie sie mit mehr Wachs auf.</li>
	<li>Stellen Sie die Form auf die Kühlplatte, und wenn das Paraffin vollständig erstarrt ist, entfernen Sie den Block mit der angebrachten Kassette von der Form.</li>
</ol>4. Gewebeschnitte
<ol><li>Setzen Sie den Block in die Probenklammer des Mikrotoms ein, setzen Sie die Klinge in die Halterung, stellen Sie den Winkel zwischen der Ebene des Blocks und der Klinge ein, stellen Sie die Dicke des Abschnitts auf 4 μm ein, drehen Sie das Handrad und beginnen Sie mit dem Schneiden.</li>
	<li>Legen Sie die entsprechende Gewebeoberfläche frei, indem Sie einige dünne Abschnitte aus dem Block schneiden. Nehmen Sie die durchgehenden und vollständigen Abschnitte mit der Bürste heraus.</li>
	<li>Wenn genügend Abschnitte geschnitten sind, hören Sie auf, das Handrad zu drehen, entfernen Sie die unqualifizierten Abschnitte am vorderen Ende mit einer Pinzette und schwimmen Sie die Abschnitte auf der Oberfläche von 42 °C heißem Wasser im Wasserbad mit Pinzette und Bürste.</li>
	<li>Nachdem die Abschnitte vollständig abgeflacht sind, die Abschnitte auf Anti-Ablösungs-Objektträgern aufnehmen und 60 Minuten lang auf einem Objektträgerwärmer bei 65 °C backen.</li>
	<li>Wenn das Backen beendet ist, nehmen Sie die Glasträger aus dem Objektträgerwärmer.</li>
</ol>5. Immunhistochemische Färbung
<ol><li>Verdünnen Sie den Primärantikörper in eine Arbeitslösung mit Antikörperverdünnungsmittel. Weitere Informationen finden Sie in Tabelle 1 .</li>
	<li>Geben Sie die verdünnte Antikörperlösung in eine spezielle Reagenzflasche und das Detektionskit in das Reagenzfach eines automatischen IHC-Färbegeräts (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Legen Sie die Objektträger auf einen Objektträgerhalter, der mit einer speziellen Abdeckung bedeckt ist, und setzen Sie sie in das experimentelle Reaktionsfach des Geräts ein.</li>
	<li>Nachdem das Gerät das Reagenz und die experimentellen Informationen auf dem Objektträger automatisch erkannt hat, klicken Sie auf die Schaltfläche Start , um die immunhistochemische Färbung zu starten. Das Experiment dauert ca. 3 h.</li>
</ol>6. Entwässerung und Versiegelung des Objektträgers
<ol><li>Nehmen Sie nach der immunhistochemischen Färbung den Objektträgerhalter heraus, nehmen Sie die spezielle Abdeckung ab, legen Sie den gefärbten Objektträger in den Objektträgerhalter und waschen Sie den restlichen Farbstoff auf dem Objektträger mit klarem Wasser ab.</li>
	<li>Füllen Sie den Objektträgerhalter in einen automatischen Eindeckbehälter (siehe Materialtabelle), wählen Sie den Trocknungs- und Versiegelungsvorgang aus und führen Sie ihn aus.</li>
	<li>Nehmen Sie die Objektträger nach dem Trocknen und Versiegeln heraus.</li>
</ol>7. Objektträger scannen
<ol><li>Legen Sie die Objektträger auf die Objektträgerablage des pathologischen Panorama-Bildscanners (siehe Materialtabelle) und legen Sie sie in das Objektträger-Scanfach des Instruments, um pathologische Panoramabilder zu scannen. Der Scanvorgang dauert 2 Minuten. Siehe Abbildung 1.</li>
</ol>8. Analyse von Bildern
<ol><li>Bild importieren<ol><li>Öffnen Sie die pathologische Bildanalyse-Software (siehe Materialtabelle) und legen Sie einen neuen Ordner an. Importieren Sie immunhistochemische Bilder, die analysiert werden sollen.</li>
	</ol></li>
	<li>Erstellen eines Gewebeklassifikators<ol><li>Markieren Sie mehrere Gewebe und leere Annotationen, um einen Klassifikator zur Identifizierung des Gewebes bzw. des leeren Bereichs zu trainieren und einzurichten.</li>
		<li>Verwenden Sie Echtzeit-Tuning, um die Erkennungskapazität der Software während der Markierungsannotation in Echtzeit zu beobachten. Wenn die Erkennung nicht rechtzeitig erfolgt, markieren Sie die Annotation und trainieren Sie erneut, bis die Gewebeerkennung korrekt ist.</li>
	</ol></li>
	<li>Analysealgorithmus erstellen<ol><li>Wählen Sie den Standardalgorithmus in der Software entsprechend der Art des Experiments aus: Multiplex-IHC.</li>
		<li>Legen Sie die Farbparameter der Zellerkennung fest, indem Sie typische negative und positive Pixel auswählen. Stellen Sie auf dieser Grundlage die Parameter von Zellkern, Zytoplasma und Zellmembran ein und beobachten Sie die Zellerkennungssituation in Echtzeit, bis die für das Bild am besten geeigneten Parameter gefunden sind.</li>
		<li>Stellen Sie die positive Zellerkennungsschwelle ein und beobachten Sie die Erkennungssituation in Echtzeit, bis die entsprechende Schwelle angepasst ist.</li>
		<li>Wählen Sie den Gewebeklassifikator im Algorithmus aus und überprüfen Sie den Gewebeteil im Gewebeklassifikator, um Zellen anhand von Geweben zu identifizieren. An dieser Stelle ist die Etablierung eines Analysealgorithmus abgeschlossen.</li>
	</ol></li>
	<li>Ausführen der Bildanalyse<ol><li>Wählen Sie den Analysebereich aus. Verwenden Sie den etablierten Algorithmus, um Bilder zu analysieren.</li>
	</ol></li>
	<li>Nachdem die Softwareanalyse abgeschlossen ist, überprüfen Sie manuell, ob die Bilderkennung korrekt ist, einschließlich Gewebeerkennung, negativer und positiver Zellerkennung.</li>
	<li>Wenn die Bilderkennung nicht genau ist, passen Sie den Algorithmus und den Parameterschwellenwert erneut an, und führen Sie die Bildanalyse erneut aus, bis Sie erfolgreich sind. Exportieren Sie die Ergebnisse der Analyse. Siehe Abbildung 1.</li>
	<li>Auch andere Immunzellen können nach den oben genannten Schritten analysiert werden (siehe Abbildung 1). Stellen Sie verschiedene Analyseparameter entsprechend der tatsächlichen Expression verschiedener Endometrium-Immunmarker (CD56+uNK-Zellen, Foxp3+Tregs, CD68+-Makrophagen, CD163+M2-Makrophagen, CD1a+DCs und CD8+T-Zellen25,26) ein.</li>
	<li>Durch die Berechnung der Software erhalten Sie den Anteil der Endometrium-Immunzellen (siehe Tabelle 2). Verwenden Sie dies, um die Konzentrationen verschiedener Immunzellen in der Gebärmutterschleimhaut von Patientinnen mit wiederholten Fehlgeburten zu bewerten.</li>
</ol>

Bildanalyse von immunhistochemisch gefärbtem Endometriumgewebe

<ol>
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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Mit diesem Protokoll wurde eine digitale immunhistochemische Bildanalyseplattform zur quantitativen Analyse von Immunzellen des Endometriums von RM-Patientinnen etabliert. Hier wurden sechs Endometrium-Immunmarker detektiert, um die Mikroumgebung des Endometriumimmuns bei RM-Patientinnen zu bewerten.
Ein rezeptives Endometrium während der mittleren Lutealphase ist der Schlüssel für eine erfolgreiche Einnistung und Schwangerschaft27,28</su...

Wiederholte Fehlgeburten (RM) sind der Verlust von zwei oder mehr aufeinanderfolgenden Schwangerschaften und sind eine komplexe Erkrankung, die in den letzten Jahren die Aufmerksamkeit von Klinikern auf sich gezogen hat. Die Inzidenzrate von RM bei Frauen im gebärfähigen Alter liegt bei 1%-5% 1. Ergebnisse früherer Studien zeigen, dass Immunfaktoren eng mit der Pathogenese von RM 2,3,4,5 assoziiert sind. Die Aufrechterhaltung der Immunhomöostase an der Schnittstelle zwischen Mutter und Fötus ist für die Einnistung und Entwicklung des Embryos erforderlich. Endometrium-Immunzellen erfüllen mehrere regulatorische Funktionen, um diese Homöostase aufrechtzuerhalten, wie z. B. die Förderung der Trophoblasteninvasion, den Umbau von Spiralarterien und die Mitwirkung an der Plazentaentwicklung 6,7,8,9.
Zuvor wurde über aberrante Immunzellen des Endometriums bei Frauen mit RM berichtet. Die Ergebnisse zeigen einen engen Zusammenhang zwischen der hohen Dichte an uterinen natürlichen Killerzellen (uNKs) und dem Auftreten von RM10,11,12. Eine erhöhte Anzahl von Makrophagen wurde im Endometrium von Frauen mit RM im Vergleich zu Frauen mit Lebendgeburt berichtet13. Regulatorische T-Zellen (Treg) spielen eine Rolle bei der mütterlichen Immuntoleranz gegenüber dem Embryo, und ihr Spiegel und ihre Funktion sind in der Dezidua von RM-Patienten verringert14. Zytotoxizität T-Zellen (CTL) und dendritische Zellen (DCs) spielen ebenfalls eine Rolle bei der Immunregulation der Schwangerschaft15,16. Daher könnte eine umfassende quantitative Analyse lokaler Immunzellen des Endometriums während der mittleren Lutealphase helfen, die Pathogenese der RM besser zu verstehen. Einige aktuelle Methoden zur quantitativen Analyse von Immunzellen des Endometriums verwenden die Durchflusszytometrie, die Immunzellen mit mehreren Markern genau markieren kann17,18. Die klinische Anwendung der Durchflusszytometrie ist jedoch begrenzt, da sie nur an frischem Gewebe durchgeführt werden kann. Die Gewinnung von frischem Gewebe ist nur möglich, wenn ein großes Volumen an überschüssigem Tumor zur Verfügung steht, was bei der Gebärmutterschleimhaut selten vorkommt. Die Immunhistochemie kann die Gewebemorphologie gut in situ beobachten und auch verschiedene Immunzellen markieren, während herkömmliche immunhistochemische Techniken keine quantitative Analyse von Immunzellen durchführen können.
Im Vergleich zu konventionellen immunhistochemischen Experimenten hat die quantitative immunhistochemische Analyse von Immunzellen im Endometrium eine wichtige klinische Bedeutung. Das IHC-Intensitäts-Scoring wird in der Regel auf einer vierstufigen Skala oder stark und schwach in der pathologischen Diagnostik und Forschung eingestuft 19,20,21. Diese semi-quantitative Technik ist jedoch subjektiv, höchst ungenau und weist eine signifikante Variabilität innerhalb und zwischen Beobachtern auf22. Eine mögliche Lösung ist die Anwendung des maschinellen Lernens, das in der digitalen Bildanalyse wertvoll ist23,24. Durch quantitative Messungen ermöglicht dieser Ansatz eine genauere Beurteilung der Infiltration, Verteilung und Dichte von Immunzellen im Gebärmuttergewebe. Diese quantitativen Informationen können dazu beitragen, die dynamischen Veränderungen in Immunzellpopulationen während des Menstruationszyklus und bei verschiedenen pathologischen Zuständen aufzuklären. Insgesamt bietet die Möglichkeit, Immunzellen in der Gebärmutterschleimhaut mittels Immunhistochemie quantitativ zu analysieren, wertvolle Einblicke in die Immunmikroumgebung der Gebärmutter.
Daher zielte das Protokoll darauf ab, eine digitale immunhistochemische Bildanalyseplattform zu entwickeln und zu validieren, um Immunzellen des Endometriums, einschließlich uNK-Zellen, Tregs, Makrophagen, DCs und zytotoxischer T-Zellen, während der mittleren Lutealphase bei RM-Patienten quantitativ zu analysieren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Automated coverslipper</td>
			<td>Sakuraus</td>
			<td>DRS-Prisma-P-JCS&#38;Film-JC2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD163</td>
			<td>GrowGn Biotechnology</td>
			<td>NCL-L-CD163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1a</td>
			<td>Gene Tech</td>
			<td>GM357129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56</td>
			<td>Gene Tech</td>
			<td>GT200529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8</td>
			<td>Novocastra</td>
			<td>NCL-L-CD8-4B11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dehydrator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Excelsior ES</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital pathology and</td>
			<td>Indica labs</td>
			<td>HALO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foxp3</td>
			<td>YILIFANG biological</td>
			<td>14-477-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IHC stainer</td>
			<td>Leica</td>
			<td>BOND III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis platform</td>
			<td>Indica labs</td>
			<td>HALO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Scanner</td>
			<td>Olympus life science</td>
			<td>VS200</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

platform for quantitative detection of endometrial immune cells based on immunohistochemistry and digital image analysis

Um die Immunumgebung des Endometriums von Patientinnen mit rezidivierenden Fehlgeburten (RM) zu bewerten, wurde eine digitale immunhistochemische Bildanalyseplattform entwickelt und validiert, um Immunzellen des Endometriums während der mittleren Lutealphase quantitativ zu analysieren. Alle Proben der Gebärmutterschleimhaut wurden während der mittleren Lutealphase des Menstruationszyklus entnommen. In Paraffin eingebettetes Endometriumgewebe wurde in 4 μm dicke Objektträger geschnitten und eine immunhistochemische (IHC) Färbung zum Nachweis von Immunzellen des Endometriums, einschließlich CD56+ uNK-Zellen, Foxp3+ Tregs, CD163+ M2-Makrophagen, CD1a+ DCs und CD8+ T-Zellen, durchgeführt. Die Panorama-Dias wurden mit einem digitalen Diascanner gescannt und für die quantitative Analyse wurde ein kommerzielles Bildanalysesystem verwendet. Der prozentuale Anteil der Immunzellen des Endometriums wurde berechnet, indem die Anzahl der Immunzellen in den gesamten Endometriumzellen geteilt wurde. Mit dem kommerziellen Bildanalysesystem konnte die quantitative Bewertung von Immunzellen des Endometriums, die mit herkömmlicher Bildanalyse nur schwer oder gar nicht analysiert werden können, einfach und genau analysiert werden. Diese Methodik kann angewendet werden, um die Mikroumgebung der Gebärmutterschleimhaut, einschließlich der Interaktion zwischen Immunzellen, und ihre Heterogenität für verschiedene Patientinnen mit reproduktivem Versagen quantitativ zu charakterisieren. Die Plattform zur quantitativen Bewertung von Immunzellen des Endometriums könnte für die Diagnose und Behandlung von RM-Patientinnen von wichtiger klinischer Bedeutung sein.

Recurrent miscarriage (RM) is the loss of two or more consecutive pregnancies and is a complex disease drawing attention from clinicians in recent years.The incidence rate of RM in women of childbearing age is 1%-5% 1. Results of previous studies show that immune factors are closely associated with the pathogenesis of RM2,3,4,5. Maintaining immune homeostasis at the maternal-fetal interface is required for embryo implantation and development. Endometrial immune cells perform several regulatory roles to maintain this homeostasis, such as promoting trophoblast invasion, remodeling spiral arteries, and contributing to placenta development6,7,8,9.
Aberrant endometrial immune cells in women with RM have previously been reported. Results show a close association between the high density of uterine natural killer cells (uNKs) and the occurrence of RM10,11,12. An increased number of macrophages has been reported in the endometrium of women with RM, compared with those who had a live birth13. Regulatory T cells (Treg) play a role in maternal immune tolerance toward the embryo, and their level and function are decreased in the decidua of RM patients14. Cytotoxicity T cells (CTL) and dendritic cells (DCs) also play a role in the immune regulation of pregnancy15,16. Therefore, a comprehensive quantitative analysis of local endometrial immune cells during the mid-luteal phase could help to better understand the pathogenesis of RM. Some current methods for quantitative analysis of endometrial immune cells use flow cytometry which can accurately label immune cells with multiple markers17,18. However, clinical application of flow cytometry is limited because it can only be performed on fresh tissue. Obtaining fresh tissue is only feasible when a large volume of excess tumor is available, a rare occurrence for endometrium. Immunohistochemistry can observe tissue morphology well in situ and can also label various immune cells, while traditional immunohistochemical techniques cannot perform quantitative analysis of immune cells.
Compared to conventional immunohistochemistry experiments, quantitative immunohistochemical analysis of immune cells in the endometrium has important clinical significance. IHC intensity scoring is usually ranked on a four-point scale or strong and weak in pathological diagnostics and research19,20,21. However, this semi-quantitative technique is subjective, highly inaccurate, and demonstrates significant intra-observer and inter-observer variability22. One possible solution is the application of machine learning, which is valuable indigital image analysis23,24. By providing quantitative measurements, this approach enables a more precise assessment of immune cell infiltration, distribution, and density within the uterine tissue. This quantitative information can help to elucidate the dynamic changes in immune cell populations during the menstrual cycle and in various pathological conditions. Overall, the ability to quantitatively analyze immune cells in the endometrium through immunohistochemistry offers valuable insights into the immune microenvironment of the uterus.
Therefore, the protocol aimed to developed and validated a digital immunohistochemistry image analysis platform to quantitatively analyze endometrial immune cells including uNK cells, Tregs, macrophages, DCs and cytotoxic T cells during the mid-luteal phase in RM patients.

Autor im Rampenlicht: Weiterentwicklung der reproduktiven Immunologie mit einem Protokoll zur quantitativen Bewertung von endometrialen Immunzellen 

Plattform zum quantitativen Nachweis von Immunzellen des Endometriums auf Basis von Immunhistochemie und digitaler Bildanalyse

Currently, it is challenging to stabilize the analysis within a certain range. It is also difficult to maintain the quality control of the experiment. Our research can help the patients with abnormal endometrial sensitivity in immune to find the cause of reproductive failure.The local proportion of immune cells in the endometrial can be stably and repeatedly detected. Our findings may promote the research progress of the endometrial sensitivity evaluation in patients with repeated implantation failure.

Um endometriale Immunzellen quantitativ zu bewerten und die durch vom Menschen verursachte Instabilität zu reduzieren, haben wir eine digitale quantitative Analyseplattform für Endometrium-Immunzellen etabliert, indem wir einen automatischen immunhistochemischen Nachweis und ein digitales quantitatives Auswertungssystem verwenden. Eine immunhistochemische Bildanalyseplattform wurde etabliert, um Immunzellen des Endometriums von Patientinnen mit wiederholten Fehlgeburten (RM) im Implantationsfenster quantitativ zu analy...

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Hier wurde eine digitale immunhistochemische Bildanalyseplattform entwickelt und validiert, um die Immunzellen des Endometriums von Patientinnen mit rezidivierenden Fehlgeburten im Implantationsfenster quantitativ zu analysieren.

To evaluate the endometrial immune microenvironment of patients with recurrent miscarriage (RM), a digital immunohistochemistry image analysis platform ...

Derzeit ist es schwierig, die Analyse innerhalb eines bestimmten Bereichs zu stabilisieren. Es ist auch schwierig, die Qualitätskontrolle des Experiments aufrechtzuerhalten. Unsere Forschung kann Patientinnen mit abnormaler Empfindlichkeit des Endometriums im Immunsystem helfen, die Ursache für Fortpflanzungsversagen zu finden.Der lokale Anteil von Immunzellen im Endometrium kann stabil und wiederholt nachgewiesen werden. Unsere Ergebnisse können den Forschungsfortschritt der Endometriumsensitivitätsbewertung bei Patientinnen mit wiederholtem Implantationsversagen fördern.

platform-for-quantitative-detection-endometrial-immune-cells-based-on

Research

JoVE Journal

Biology

Platform for Quantitative Detection of Endometrial Immune Cells Based on Immunohistochemistry and Digital Image Analysis

759 Aufrufe.  Shenzhen Zhongshan Urology Hospital. Derzeit ist es schwierig, die Analyse innerhalb eines bestimmten Bereichs zu stabilisieren. Es ist auch schwierig, die Qualitätskontrolle des Experiments aufrechtzuerhalten. Unsere Forschung kann Patientinnen mit abnormaler Empfindlichkeit des Endometriums im Immunsystem helfen, die Ursache für Fortpflanzungsversagen zu finden.Der lokale Anteil von Immunzellen im Endometrium kann stabil und wiederholt nachgewiesen werden. Unsere Ergebnisse können den Forschungsfortschritt der Endome...

Serie: Autor im Rampenlicht: Weiterentwicklung der reproduktiven Immunologie mit einem Protokoll zur quantitativen Bewertung von endometrialen Immunzellen 

To evaluate the endometrial immune microenvironment of patients with recurrent miscarriage (RM), a digital immunohistochemistry image analysis platform was developed and validated to quantitatively analyze endometrial immune cells during the mid-luteal phase. All endometrium samples were collected during the mid-luteal phase of the menstrual cycle. Paraffin-embedded endometrial tissues were sectioned into 4 &#181;m thick slides, and immunohistochemistry (IHC)staining was carried out for detecting endometrial immune cells, including CD56+ uNK cells, Foxp3+ Tregs, CD163+ M2 macrophages, CD1a+ DCs, and CD8+ T cells. The panoramic slides were scanned using a digital slide scanner and a commercial image analysis system was used for quantitative analysis. The percentage of endometrial immune cells was calculated by dividing the number of immune cells in the total endometrial cells. Using the commercial image analysis system, quantitative evaluation of endometrial immune cells, which are difficult or impossible to analyze with conventional image analysis, could be easily, and accurately analyzed. This methodology can be applied to quantitatively characterize the endometrium microenvironment, including interaction between immune cells, and its heterogeneity for different reproductive failure patients. The platform for quantitative evaluation of endometrial immune cells may be of important clinical significance for the diagnosis and treatment of RM patients.

Here, a digital immunohistochemistry image analysis platform was developed and validated to quantitatively analyze the endometrial immune cells of patients with recurrent miscarriages in the window of implantation.

Forschung

Biologie

Dehydration of Human Endometrial Tissue for Sectioning

To begin, use tweezers to transfer the endometrial tissue from the formalin onto the embedding paper. With a ruler, measure the dimensions of the endometrial tissue. Now wrap the tissue in the embedding paper and place it into an embedding cassette.Transfer the cassette into the tissue basket for dehydration. To dehydrate the endometrial tissue, place the tissue basket in the reaction chamber of the dehydrator and initiate the procedure for routine tissue dehydration. Once the dehydration is complete, open the reaction chamber of the dehydrator and remove the tissue basket.

Dehydratisierung von menschlichem Endometriumgewebe für den Schnitt

Human Endometrial Tissue Embedding and Sectioning for Immunohistochemistry and Digital Image Analysis

To begin, select an appropriate embedding mold that matches the size of the dehydrated endometrial specimen. Fill it with paraffin wax, heated at 70 degrees Celsius. Immediately place the dehydrated human endometrial tissue in the mold.Use forceps to carefully adjust the tissue, to ensure it is placed centrally. Now, transfer the mold to the cooling plate and gently press the tissue with tweezers as the paraffin at the bottom solidifies. Place the embedded cassette over the mold, and top it with more wax.Then place the mold back on the cooling plate. Once the paraffin has solidified completely, remove the block and its attached cassette from the mold. For sectioning, insert the block onto the sample clip of the microtome.Place the blade into the holder and adjust the angle between the blocks plane and the blade. Now adjust the thickness of the section to four micrometers. Then turn the hand wheel to start slicing.Cut thin sections from the block to expose the appropriate tissue surface. Use the brush to gather the continuous and complete sections. Once enough sections have been obtained, use tweezers to remove the unqualified sections at the front.With a brush, transfer the sections into a warm water bath, heated to 42 degrees Celsius. When the sections have fully flattened out, use anti detachment slides to lift them. Next, bake them in a slide warmer at 65 degrees Celsius for over 60 minutes before removing.

Einbettung und Schnitt von menschlichem Endometriumgewebe für die Immunhistochemie und digitale Bildanalyse

Tissue Immunohistochemical Staining of Sectioned Human Endometrial Tissue

To begin, transfer the diluted antibody solution into a special reagent bottle. Insert the detection kit into the reagent compartment of an automatic immunohistochemical standing instrument. Next, set the slides with the sectioned endometrial tissue on a slide holder and cover them with a special cover tile.Then insert the holder into the experimental reaction compartment of the instrument. Once the instrument automatically recognizes the information on the reagent and slide, press the start button to initiate the immunohistochemical staining. After staining, take out the slide holder.Put the stained slide into the slide holder to wash off any remaining dye with clean water. Now, place the slide holder onto an automated cover slipper and run the dehydration and sealing procedure. Remove the slides once dehydration and sealing are complete.

Immunhistochemische Gewebefärbung von geschnittenem menschlichem Endometriumgewebe

Tissue Scanning and Image Analysis of Immunohistochemically Stained Human Endometrium

To start, place the slides with the immunohistochemically stained endometrial sections on the slide rack of a panoramic pathological image scanner. Then, place the rack in the instrument's slide scanning compartment to initiate scanning. Once scanning is complete, launch the image analysis software and create a new folder.Import the images that require analysis. To build a tissue classifier, mark several tissues along with a blank annotation to establish a classifier that identifies the tissue and blank areas. Use realtime tuning to observe the software's recognition capacity during the mark annotation.To build an analysis algorithm, select the standard multiplex IHC algorithm in the software and choose the negative and positive pixels to set the color parameters of cell recognition. Establish the parameters of the nucleus, cytoplasm, and cell membrane until the optimal parameters for the image are found. Now, set the positive cell recognition threshold and optimize it until an appropriate threshold is obtained.Next, select the tissue classifier in the algorithm. Check the tissue part within it to identify cells based on tissues. Select the analysis area and then use the established algorithm to analyze the images.Once the analysis is complete, manually check the accuracy of tissue recognition, negative and positive recognition. If the image recognition is inaccurate, adjust the algorithm and parameter thresholds again. Run the image analysis until it is successful.Then, export the results of the analysis. Set the different analysis parameters according to the expression of different endometrial immune markers. Use the software to calculate the proportion of endometrial immune cells.Following calculation, use the values to assess the levels of various immune cells in the endometrium of patients with recurrent miscarriage. Different immune cells were immunohistochemically stained based on their individual expression of different markers. The brown stain represents the positive immune cells and the blue represents the nucleus.Different immune cells were expressed in women with recurrent miscarriages. CD56 cells appear to be predominant at 16.76%with CD1a and Foxp3 cells making up 0.11 to 0.12%of the immune cell population.