Die Autoren möchten die vielen Beiträge auf diesem Gebiet würdigen, die in dieser Arbeit aus Platzgründen nicht zitiert wurden, sowie die Förderorganisationen, die diese Möglichkeit zur Verfügung gestellt haben. Die Autoren danken für die Finanzierung durch den Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) und die Canadian Institutes of Health Research (CIHR), die diese Arbeit unterstützt haben. K.M. ist Empfänger eines CGS-M-Stipendiums von NSERC und eines Killam-Doktorandenstipendiums von der University of British Columbia. N.S. ist Empfänger eines Michael Smith Health Research BC Scholar Award.

1. Vorbereitung von Reagenzien für die mPSC-Kultur
<ol><li>N2-Ergänzung vorbereiten.<ol><li>Unter nicht sterilen Bedingungen werden die folgenden Stammlösungen (Schritt 1.1.1.1) in einem chemischen Sicherheitsabzug hergestellt. Geben Sie das feste Pulver jeder Chemikalie in ein vorgewogenes konisches 50-ml-Röhrchen. Wiegen Sie jedes Röhrchen nach Zugabe des Pulvers und fügen Sie eine angemessene Menge Lösungsmittel hinzu, um die folgenden Konzentrationen zu erreichen. Bereiten Sie für einen Medienstapel die angegebene Mindestmenge vor. HINWEIS: Die folgenden Reagenzien sind gefährlich und sollten in Übereinstimmung mit den örtlichen Chemikaliensicherheitsrichtlinien gehandhabt werden. Achten Sie bei der Handhabung auf die richtige PSA und arbeiten Sie nur mit den festen Pulverformen dieser Chemikalien in einem chemischen Abzug, um ein Einatmen zu verhindern.<ol><li>Mindestens 0,05 ml Natriumselenit in Wasser bei 0,518 mg/ml, 0,5 ml Putrescin in Wasser bei 160 mg/ml, 0,165 ml Progesteron in 100% Ethanol bei 0,6 mg/ml (siehe Materialtabelle).</li>
			<li>Lagern Sie Lösungen bis zu 2 Jahre bei -20 °C.</li>
		</ol></li>
		<li>In einer Biosicherheitswerkbank (BSC) fügen Sie Folgendes zu 58,035 ml DMEM-F12 hinzu.<ol><li>0,05 ml einer 0,518 mg/ml Natriumselenitlösung, 0,5 ml einer 160 mg/ml Putrescinlösung, 0,165 ml einer 0,6 mg/ml Progesteronlösung.</li>
			<li>Filter Sterilisieren Sie die obige Mischung mit einem 0,22-μm-Filter.</li>
		</ol></li>
		<li>Bereiten Sie immer noch in der BSC eine 100 mg/ml-Lösung von Apotransferrin vor.<ol><li>Fügen Sie 5 ml DMEM-F12 zu 500 mg Apotransferrin hinzu (siehe Materialtabelle). Den Behälter langsam wieder aufhängen und waschen, Blasen vermeiden.</li>
			<li>Nachdem Sie es mit 5 ml resuspendiert und so viel wie möglich entfernt haben, fügen Sie es der Selenit/Putrescin/Progesteron-Lösung hinzu. Nehmen Sie mehr von der vorherigen Lösung und waschen Sie die Apotransferrinflasche, um so viel wie möglich davon herauszuholen.</li>
		</ol></li>
		<li>Geben Sie 5 ml 7,5 % BSA-Fraktion V (siehe Materialtabelle) in die Lösung.</li>
		<li>Mischen und aliquotieren Sie 6,875 ml pro Röhrchen. Aliquote bis zu 1 Jahr bei -80 °C lagern.</li>
		<li>Wenn Sie die oben genannten N2-Aliquots zur Herstellung von N2B27-Medien verwenden, tauen Sie das gewünschte Aliquot auf und fügen Sie 3,125 ml einer 4 mg/ml-Insulinlösung (siehe Materialtabelle) zu den 6,875 N2 hinzu, um 10 ml 100x N2 zu erhalten.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiten Sie N2B27-Basalmedien vor.<ol><li>Tauen Sie N2- und B27-Ergänzungen einige Stunden oder über Nacht in einem 4 °C-Kühlschrank auf.</li>
		<li>Mischen Sie in einer BSC 484,5 ml DMEM-F12 und 484,5 ml neurobasales Medium (siehe Materialtabelle) in einer sterilen 1-l-Flasche.</li>
		<li>Fügen Sie dem Medium 10 ml B27 und 10 ml N2-Ergänzung hinzu.</li>
		<li>Fügen Sie 1 ml 55 mM Beta-Mercaptoethanol hinzu (siehe Materialtabelle). Fügen Sie 10 ml 100x Glutamax hinzu. Mischen Sie kräftig, indem Sie die Flasche schwenken.</li>
		<li>Aliquotieren Sie das gewünschte Volumen pro Aliquot (typischerweise 100 ml) und lagern Sie es bis zu 1 Jahr bei -80 °C. Nach dem Auftauen bei 4 °C bis zu 3 Wochen im Gebrauch lagern.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiten Sie NBiL-Medien vor.<ol><li>Tauen Sie ein 100-ml-Aliquot von N2B27-Basalmedien bei -80 °C im 4 °C-Kühlschrank auf.</li>
		<li>In einer BSC wird LIF (siehe Materialtabelle) bis zu einer Endkonzentration von 10 μg/l hinzugefügt.</li>
		<li>Fügen Sie CHIR99021 (3 μM endg.) und PD0325901 (1 μM endg.) hinzu (siehe Materialtabelle). Mit einer serologischen 50-ml-Pipette gut mischen. Bei 4 °C bis zu 2 Wochen lagern.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiten Sie 0,2% ige Gelatinelösung vor.<ol><li>500 ml doppelt destilliertes H2O in eine 1-Liter-Glasflasche umfüllen.</li>
		<li>Messen Sie 1 g Gelatine ab (siehe Materialtabelle) und geben Sie sie in das Wasser. Mischen Sie, indem Sie die Flasche schütteln, bis sie sich weitgehend aufgelöst hat.</li>
		<li>Autoklavieren Sie die Gelatine-Wasser-Mischung bei 15 psi, 121 °C für 35 min. Nach dem Abkühlen mit einem 0,22-μm-Filter in einem BSC filtern. Bei 4 °C lagern.</li>
	</ol></li>
	<li>Waschmedien vorbereiten.<ol><li>Mischen Sie in einem BSC 160 μl 7,5 % BSA pro 10 ml DMEM-F12.</li>
		<li>Skalieren Sie die oben genannten und bereiten Sie sie in großen Mengen für eine einfache zukünftige Verwendung vor (z. B. 8 ml 7,5 % BSA auf 500 ml DMEM-F12). Bei 4 °C lagern.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Vorbereitung von Reagenzien für die mPSC-Polytransfektion
HINWEIS: Die folgenden Werte gelten für eine einzelne Vertiefung einer 24-Well-Platte. Die Werte können entsprechend skaliert werden. Die Sequenzen aller DNA/Plasmide sind in der Zusatzdatei 1 detailliert beschrieben.
<ol><li>Berechnen Sie das Volumen der DNA-Lösung, die pro Behandlung benötigt wird.<ol><li>Bereiten Sie 500 ng DNA pro Well/Zustand vor.<ol><li>Wenn ein einzelnes Plasmid mit einer DNA-Lösung von 100 ng/μl transfiziert wird, bereiten Sie ein Röhrchen mit 5 μl DNA vor.</li>
			<li>Wenn zwei Plasmide mit jeweils 100 ng/μl transfiziert werden, bereiten Sie zwei Röhrchen mit jeweils 2,5 μl vor, eines für jedes Plasmid.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Führen Sie in einer BSC Folgendes durch: Aliquotieren Sie für jede 500-ng-Transfektionsbehandlung (siehe Materialtabelle) 25 μl OptiMEM in ein 1,5-ml-Röhrchen.<ol><li>Skalieren Sie dies entsprechend - für das obige Beispiel bereiten Sie zwei Röhrchen mit jeweils 250 ng DNA (2,5 μl) und 12,5 μl OptiMEM vor.</li>
	</ol></li>
	<li>Geben Sie das erforderliche DNA-Volumen für diese Behandlung in das OptiMEM im Röhrchen.</li>
	<li>Stellen Sie für jedes Röhrchen mit 500 ng DNA und OptiMEM ein passendes Röhrchen mit weiteren 25 μl OptiMEM und 1 μl kationischem Transfektionsreagenz auf Lipidbasis her.<ol><li>Auch diese Werte müssen entsprechend skaliert werden. Bereiten Sie für das obige Beispiel zwei Röhrchen mit jeweils 12,5 μl OptiMEM und 0,5 μl Transfektionsreagenz vor. HINWEIS: Verwenden Sie beim Skalieren von Werten die Masse der hinzugefügten DNA, nicht das Volumen, das für diese DNA-Menge erforderlich ist. Reaktionen mit Transfektionsreagenz und DNA können skaliert werden (z. B. wenn 5 Wells mit derselben DNA transfiziert werden sollen). Lassen Sie die Verhältnisse der Reagenzien gleich, skalieren Sie jedoch entsprechend (z. B. 1000 ng DNA: 50 μl OptiMEM: 2 μl Transfektionsreagenz: 50 μl OptiMEM).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Vorbereitung von mPS-Zellen für die Transfektion
HINWEIS: Bereiten Sie für die umgekehrte Transfektion das Kulturgefäß vor und passieren Sie die mPSCs direkt, bevor Sie die Transfektionsreagenzien hinzufügen. Für die Vorwärtstransfektion die Zellen 12-18 Stunden vor der Transfektion durchlassen und plattieren, damit die Zellen an der Platte haften können.
<ol><li>Bereiten Sie ein mit 0,2 % gelatinebeschichtetes Zellkulturgefäß vor.<ol><li>Planen Sie die Anzahl der für die Transfektion benötigten Wells (ein Well einer 24-Well-Platte pro Behandlung/Gruppe).</li>
		<li>Geben Sie 200 μl der 0,2%igen Gelatinelösung in jede der gewünschten Vertiefungen in der 24-Well-Platte.</li>
		<li>Schütteln Sie die Platte vorsichtig, um die Lösung gleichmäßig zu verteilen, und stellen Sie sicher, dass sie den gesamten Boden der Vertiefung bedeckt.</li>
		<li>Lassen Sie die Vertiefungen mindestens 15 Minuten bei Raumtemperatur beschichten.</li>
		<li>Entfernen Sie mit einem Vakuumsauger vorsichtig alle Gelatinereste aus den Vertiefungen (kippen Sie die Platte, um sicherzustellen, dass die gesamte Flüssigkeit entfernt wird, ohne die Gelatineschicht abzukratzen).</li>
		<li>Geben Sie 0,5 ml NBiL-Medien (Schritt 1.3) in jede Vertiefung und lassen Sie die Platte zum Vorwärmen in einem Gewebekultur-Inkubator.</li>
	</ol></li>
	<li>Passage mPSCs.<ol><li>Aliquotieren Sie 30 ml Waschmedium (Schritt 1.5) in ein konisches 50-ml-Röhrchen.</li>
		<li>Aspirieren Sie die alten Medien aus der Gewebekulturschale von mES-Zellen. HINWEIS: Mehrere Aspirationstechniken sind zulässig. Unabhängig davon, welche Technik gewählt wird, stellen Sie sicher, dass die Zellen nicht über längere Zeiträume (maximal ca. 30 s) trocken bleiben.</li>
		<li>Fügen Sie die erforderliche Menge des handelsüblichen Zellentfesselungsmediums hinzu (1,5 ml für eine 10-cm-Schale, entsprechend skalieren, siehe Materialtabelle).</li>
		<li>Warten Sie 3-5 Minuten, bevor Sie 15-20 Mal mit einer P1000-Pipette auf und ab pipettieren, um eine Einzelzellensuspension zu erhalten. Betrachten Sie Zellen unter einem Mikroskop, um eine Einzelzellsuspension zu gewährleisten.</li>
		<li>Übertragen Sie die Zellen im Trennmedium in das 50-ml-Röhrchen mit dem Waschmedium.</li>
		<li>Bei 300 x g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Saugen Sie das Waschmedium an und stellen Sie sicher, dass keine Restflüssigkeit im Rohr verbleibt.</li>
		<li>Resuspendieren Sie das Pellet in einer kleinen Menge Waschmedium (~300 μl). Zählen Sie die Zellsuspension mit einem Hämozytometer, um die Zelldichte zu erhalten.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Rückwärtstransfektion von mPS-Zellen
<ol><li>Bereiten Sie Polytransfektionsreagenzien gemäß Schritt 2 vor.</li>
	<li>Bereiten Sie das Zellkulturgefäß und die Passage-mPSCs gemäß Schritt 3 vor.</li>
	<li>Aliquotieren Sie 200 μl NBiL-Medien auf 1,5 ml-Röhrchen, eines für jede Behandlung.</li>
	<li>Geben Sie 26 μl des OptiMEM:Transfektionsreagenzgemisches in das DNA:OptiMEM-Gemisch. Mischen Sie die Reagenzien schnell und kräftig, indem Sie sie etwa 10 Mal pipettieren. Lassen Sie die Mischung 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Übertragen Sie basierend auf der Zelldichte das erforderliche Zellvolumen von der 300-μl-Zellsuspension auf die 200-μl-NBiL-Röhrchen, um 25.000 Zellen pro Röhrchen zu erhalten.</li>
	<li>Nach 5 Minuten Inkubation des Lipofectamine 2000 (L2K, Transfektionsreagenz) und der DNA-Mischung in das 1,5-ml-Zellröhrchen geben und durch Pipettieren gut mischen. Lassen Sie die Zellen 5 Minuten lang bei Raumtemperatur mit dem Reagenz inkubieren.</li>
	<li>Bei 300 x g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Pipettieren Sie die Flüssigkeit heraus und lassen Sie ca. 50 μl übrig.</li>
	<li>Resuspendieren Sie das Zellpellet mit 100 μl NBiL-Medien. Übertragen Sie die Zellen auf die Platte und legen Sie die Platte in den Inkubator. Wechseln Sie das Medium 24 h später mit frischen NBiL-Medien.</li>
</ol>5. Vorwärtstransfektion von mPS-Zellen
<ol><li>12-18 h vor der Transfektion das Zellkulturgefäß und die Passage-mPSCs gemäß Schritt 3 vorbereiten.</li>
	<li>Übertragen Sie basierend auf der Zelldichte das erforderliche Zellvolumen aus der 300-μl-Zellmischung auf 25.000 Zellen pro Well. Legen Sie die Platte in den Inkubator.</li>
	<li>1 h vor der Transfektion das Medium aus allen Wells absaugen und durch 0,5 ml NBiL-Medium ersetzen. Legen Sie die Platte in den Inkubator.</li>
	<li>Bereiten Sie zum Zeitpunkt der Transfektion mPSC-Polytransfektionsreagenzien gemäß Schritt 2 vor.</li>
	<li>Geben Sie 26 μl des OptiMEM:Transfektionsreagenzgemisches in das DNA:OptiMEM-Gemisch. Mischen Sie die Reagenzien schnell und kräftig, indem Sie sie etwa 10 Mal pipettieren. Lassen Sie die kombinierte Mischung 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Geben Sie die kombinierte Mischung tropfenweise in die Vertiefungen. Legen Sie die Platte in den Inkubator. Wechseln Sie das Medium 24 h später.</li>
</ol>6. Durchflusszytometrie
<ol><li>Aspirieren Sie das Medium 48 Stunden nach der Transfektion aus der transfizierten 24-Well-Platte.</li>
	<li>200 μl Trypsin in jede Vertiefung geben, schwenken und 30 s bei 37 °C inkubieren. Klopfen Sie auf die Seiten der Platte und fügen Sie 200 μl eiskalten FACS-Puffer (2% FBS in PBS) hinzu.</li>
	<li>Öffnen und beschriften Sie eine 96-Well-Platte mit V-Boden, beginnend mit A1. Mischen Sie den Inhalt jeder Vertiefung auf der transfizierten Platte, um Zellen zu entfernen, und stellen Sie Einzelzelllösungen mit einer P200-Pipette her. Übertragen Sie 200 μl aus jeder Vertiefung in die entsprechende Vertiefung auf der 96-Well-Platte.</li>
	<li>Geben Sie 15 ml FACS-Puffer in ein 50-ml-Reagenzreservoir. Die Platte bei 300 x g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand, indem Sie die 96-Well-Platte mit einer schnellen und gleichmäßigen Bewegung in die Spüle umdrehen.</li>
	<li>Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um die Pellets auf der 96-Well-Platte in 150 μl FACS-Puffer aus dem Reagenzreservoir zu resuspendieren. Wiederholen Sie die Schritte 6.4-6.5 zweimal. Legen Sie die 96-Well-Platte in eine mit Eis gefüllte Box, die vor Licht geschützt ist.</li>
	<li>Führen Sie die Proben durch ein Durchflusszytometer, um die Populationsverteilungen der fluoreszierenden Reporter zu erhalten.<ol><li>Stellen Sie sicher, dass das Zytometer in Bezug auf Laser- und Filterkombinationen für das durchzuführende Experiment geeignet ist (verwenden Sie z. B. keinen Infrarot-Reporter, wenn es nicht möglich ist, im dunkelroten Spektrum anzuregen oder zu detektieren).</li>
		<li>Fügen Sie zusätzliche Proben für Standardisierungsperlen hinzu, um eine MEFL-Konvertierung der Daten während der Analyse zu ermöglichen. Stellen Sie sicher, dass genügend Zellen pro Probe für eine angemessene statistische Analyse gesammelt werden9.</li>
	</ol></li>
	<li>Konvertieren Sie Fluoreszenzeinheiten aus den Rohzytometerdateien und analysieren Sie die Daten mit einer von mehreren Methoden, wie z. B. Python- oder MATLAB-basierten Pipelines oder kommerziell erhältlicher Software 9,13.</li>
</ol>

Vergleichende Analyse von Vorwärts- und Rückwärtstransfektionsmethoden an mPSCs

<ol>
	<li>Shakiba, N., Jones, R. D., Weiss, R., Del Vecchio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Context-aware+synthetic+biology+by+controller+design:+Engineering+the+mammalian+cell.">Context-aware synthetic biology by controller design: Engineering the mammalian cell.</a> Cell Systems. 12 (6), 561-592 (2021).</li><li>Fus-Kujawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+methods+and+tools+for+transfection+of+eukaryotic+cells+in+vitro.">An overview of methods and tools for transfection of eukaryotic cells in vitro.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, (2021).</li><li>FAU, K. T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+cell+transfection:+the+present+and+the+future.">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li><li>Tamm, C., Galit&#243;, S. P., Anner&#233;n, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+protocols+for+mouse+embryonic+stem+cell+culturing.">A comparative study of protocols for mouse embryonic stem cell culturing.</a> PLoS One. 8 (12), 81156 (2013).</li><li>Morgani, S., Nichols, J., Hadjantonakis, A. 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X., Yeap, S. K., Ho, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+types,+methods+and+strategies:+A+technical+review.">Transfection types, methods and strategies: A technical review.</a> PeerJ. 9, 11165 (2021).</li><li>Gam, J. J., DiAndreth, B., Jones, R. D., Huh, J., Weiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+&amp;#34;poly-transfection&amp;#34;+method+for+rapid,+one-pot+characterization+and+optimization+of+genetic+systems.">A &amp;#34;poly-transfection&amp;#34; method for rapid, one-pot characterization and optimization of genetic systems.</a> Nucleic Acids Research. 47 (18), 106 (2019).</li><li>Jones, R. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+extract+based+optimization+of+biomolecular+circuits+with+droplet+microfluidics.">Cell-free extract based optimization of biomolecular circuits with droplet microfluidics.</a> Lab on a Chip. 17 (18), 3037-3042 (2017).</li><li>Teague, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoflow:+A+python+toolbox+for+flow+cytometry.">Cytoflow: A python toolbox for flow cytometry.</a> bioRxiv. , (2023).</li><li>Qin, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+comparison+of+constitutive+promoters+and+the+doxycycline-inducible+promoter.">Systematic comparison of constitutive promoters and the doxycycline-inducible promoter.</a> PLoS One. 5 (5), 0010611 (2010).</li></ol>

Die Autoren berichten von keinen Interessenkonflikten.

Ein Hauptgrund für die weit verbreitete Einführung von Transfektionsprotokollen ist ihre Reproduzierbarkeit und Zugänglichkeit; Diese Protokolle erfordern jedoch eine Optimierung in experimentellen Kontexten. Nicht erwähnt sind die Standardtests, die erforderlich sind, wenn zum ersten Mal versucht wird, eine neue Zelllinie zu transfizieren. Erstens ist die Wahl des Transfektionsreagenzes entscheidend, da kommerziell erhältliche Reagenzien keine Einheitsgröße sind und in der Effizienz der NA-Verabreichungsfähigkei...

Die Verabreichung von DNA und RNA in Säugetierzellen dient als Kernpfeiler der biomedizinischen Forschung1. Eine gängige Methode zur Einführung exogener Nukleinsäuren (NA) in Säugetierzellen ist die transiente Transfektion 2,3. Diese Technik beruht auf dem Mischen von NA mit kommerziell erhältlichen Transfektionsreagenzien, die in der Lage sind, sie in die Empfängerzellen zu bringen. Typischerweise wird NA durch Vorwärtstransfektion abgegeben, bei der Zellen, die an einer zweidimensionalen Oberfläche haften, den Transfektionskomplex erhalten. Während die Vorwärtstransfektion für die gängigsten etablierten Zelllinien robust ist und die Protokolle gut veröffentlicht sind, lassen sich Nischenzelltypen mit Nicht-Monolayer-Morphologien nicht leicht transfizieren, was die Menge an NA, die abgegeben werden kann, und die Anzahl der Zellen, die sie erhalten, begrenzt.
Pluripotente Stammzellen (PSCs) dienen als attraktives Modell für das Verständnis der Entwicklung und als Werkzeug für die regenerative Medizin, da sie sich unbegrenzt teilen und jeden Körperzelltyp produzieren können. Bei Maus-PSCs (mPSCs) behalten routinemäßige In-vitro-Kulturbedingungen mit 2 Inhibitoren und LIF (2i/LIF) eine kuppelartige Koloniemorphologie bei, die die Anzahl der Zellen, die einer Vorwärtstransfektion ausgesetzt sind, direkt begrenzt 4,5,6. Um dies zu beheben, kann eine umgekehrte Transfektion durchgeführt werden: Zellen werden in eine Schale gegeben, die Medien und Transfektionsreagenz enthält, anstatt Transfektionsreagenz zu adhärenten Zellenhinzuzufügen 7. Dies erhöht zwar die Anzahl der Zellen, die dem Reagenz ausgesetzt sind, erfordert aber auch, dass die Zellen gleichzeitig durchgelassen und transfiziert werden.
Über einfache Einzel-NA-Transfektionen hinaus zielen Forscher oft darauf ab, mehrere NA-Konstrukte in vitro in eine Zellpopulation einzubringen. Dies wird typischerweise durch eine Co-Transfektion erreicht, bei der die NAs in einem bestimmten Verhältnis (1:1, 9:1 usw.) gemischt und dann mit dem gewählten Transfektionsreagenz8 kombiniert werden. Dies ergibt eine Mischung aus NAs und Reagenzien, die das ursprüngliche Verhältnis von NAs zueinander beibehält - während die Zellen in der Behandlung unterschiedliche Mengen dieser Mischung erhalten können, erhalten sie alle das gleiche Verhältnis9. Dies ist zwar von Vorteil, wenn das gewünschte Verhältnis der Teile bekannt ist, aber die Bestimmung dieses Verhältnisses im Voraus kann arbeitsintensiv sein, da jedes Verhältnis eine andere Bedingung darstellt. Eine Alternative besteht darin, eine "Polytransfektion" durchzuführen, bei der einzelne NAs unabhängig voneinander mit dem Transfektionsreagenz gemischt werden9. Durch die Kombination von Transfektionskomplexen, die einzelne NAs enthalten (anstatt NAs zu kombinieren, bevor die Komplexe erstellt werden), können Forscher eine breite Palette von NA-Stöchiometrien in einem einzigen Transfektionsexperiment untersuchen9. Dies ist besonders wertvoll in Fällen, in denen erwartet wird, dass die Produkte mehrerer NAs miteinander interagieren, wie z. B. bei induzierbaren Transkriptionssystemen oder Systemen mit in 1,10,11 eingebauter Rückkopplung. Um dies effektiv zu tun, ist jedoch eine hohe Transfektionseffizienz erforderlich. In der Tat nimmt mit zunehmender Anzahl einzigartiger transfizierter NAs die Wahrscheinlichkeit, dass eine bestimmte Zelle alle gewünschten NAs erhält, exponentiell ab 9,12.
Der folgende Bericht beschreibt ein reverses Transfektionsprotokoll für mPSCs unter Verwendung eines kationischen Transfektionsreagenzes auf Lipidbasis, bei dem die Zellen maximal 5 Minuten lang dem Reagenz-NA-Mix ausgesetzt werden, um die Lebensfähigkeit zu maximieren und die Zeit außerhalb typischer Kulturbedingungen zu minimieren. Der Vergleich dieses Protokolls mit der Standard-Vorwärtstransfektion dieser Zellen zeigt eine höhere Transfektionseffizienz und eine Erhöhung der Gesamtzahl der überlebenden transfizierten Zellen. Durch die Kombination dieser umgekehrten Transfektion mit einer Drei-Plasmid-Polytransfektion unter Einbeziehung einfacher fluoreszierender Reporter wird ein erweitertes Potenzial für das Screening von NA-Verhältnissen mit hoher Transfektionseffizienz demonstriert.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accutase&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SCR005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apotransferrin&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>T1147-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA fraction V (7.5%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15260-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SML1046-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>D6421-24X500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry standardization beads</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>URCP-38-2K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX supplement&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12585-0014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-019</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal media</td>
			<td>ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD0325901&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>PZ0162-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td>Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P6780</td>
			<td>Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mLIF&#160;</td>
			<td>BioTechne</td>
			<td>8878-LF-500/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium selenite&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S5261-25G</td>
			<td>Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an optimized mouse embryonic stem cell based reverse poly-transfection technique for rapid exploration of nucleic acid ratios

Aufgrund ihrer relativen Einfachheit und Benutzerfreundlichkeit ist die transiente Transfektion von Säugetierzelllinien mit Nukleinsäuren zu einer tragenden Säule in der biomedizinischen Forschung geworden. Während die meisten weit verbreiteten Zelllinien robuste Protokolle für die Transfektion in adhärenten zweidimensionalen Kulturen haben, lassen sich diese Protokolle oft nicht gut auf weniger untersuchte Linien oder solche mit atypischen, schwer zu transfizierenden Morphologien übertragen. Unter Verwendung von pluripotenten Stammzellen der Maus, die in 2i/LIF-Medien, einem weit verbreiteten Kulturmodell für die regenerative Medizin, gezüchtet wurden, skizziert diese Methode ein optimiertes, schnelles umgekehrtes Transfektionsprotokoll, das eine höhere Transfektionseffizienz erreichen kann. Unter Nutzung dieses Protokolls wird eine Polytransfektion mit drei Plasmiden durchgeführt, wobei die überdurchschnittlich hohe Effizienz bei der Plasmidabgabe genutzt wird, um einen erweiterten Bereich der Plasmidstöchiometrie zu untersuchen. Dieses umgekehrte Polytransfektionsprotokoll ermöglicht eine experimentelle Eintopfmethode, die es den Anwendern ermöglicht, die Plasmidverhältnisse in einem einzigen Well zu optimieren, anstatt über mehrere Co-Transfektionen hinweg. Durch die schnelle Erforschung der Auswirkungen der DNA-Stöchiometrie auf die Gesamtfunktion der gelieferten genetischen Schaltkreise minimiert dieses Protokoll den Zeit- und Kostenaufwand für die Transfektion embryonaler Stammzellen.

Delivery of DNA and RNA into mammalian cells serves as a core pillar of biomedical research1. A common method for introducing exogenous nucleic acids (NA) into mammalian cells is through transient transfection2,3. This technique relies on mixing NA with commercially available transfection reagents capable of delivering them into the recipient cells. Typically, NA is delivered via forward transfection, where cells adhering to a two-dimensional surface receive the transfection complex. While forward transfection for the most common established cell lines is robust and protocols are well-published, more niche cell types with non-monolayer morphologies do not transfect easily, limiting the amount of NA that can be delivered and the number of cells that receive it.
Pluripotent stem cells (PSCs) serve as an attractive model for understanding development and as a tool for regenerative medicine, given their ability to divide indefinitely and produce any bodily cell type. For mouse PSCs (mPSCs), routine in vitro culture conditions with 2 inhibitors and LIF&#160;(2i/LIF) maintain a dome-like colony morphology, directly limiting the number of cells exposed to a forward transfection4,5,6. To address this, a reverse transfection can be performed: cells are added to a dish containing media and transfection reagent, rather than adding transfection reagent to adherent cells7. While this increases the number of cells exposed to the reagent, it also requires the cells to be passaged and transfected concurrently.
Moving beyond simple single-NA transfections, researchers often aim to deliver several NA constructs into a population of cells in vitro. This is typically achieved through a co-transfection, where the NAs are mixed at a given ratio (1:1, 9:1, etc.) and are then combined with the chosen transfection reagent8. This yields a mix of NAs and reagent that preserves the original ratio of NAs to one another - while cells in the treatment may receive different amounts of this mix, they all receive the same ratio9. While this is advantageous when the desired ratio of parts is known, determining this ratio ahead of time can be labor-intensive, with each ratio constituting a different condition. One alternative is to perform a &#34;poly-transfection,&#34; where individual NAs are mixed with the transfection reagent independently from one another9. By combining transfection complexes containing individual NAs (rather than combining NAs before creating the complexes), researchers can explore a wide array of NA stoichiometries in a single transfection experiment9. This is particularly valuable in cases where the products of several NAs are expected to interact with one another, such as with inducible transcription systems or systems with feedback built in1,10,11. However, to do so effectively, a high transfection efficiency is needed. Indeed, as the number of unique transfected NAs increases, the probability of a given cell receiving all of the desired NAs decreases exponentially9, 12.
The following report describes a reverse transfection protocol for mPSCs using a cationic lipid-based transfection reagent, in which cells are exposed to the reagent-NA mix for a maximum of 5 min to maximize viability and minimize the time outside of typical culture conditions. Comparing this protocol to the standard forward transfection of these cells demonstrates a higher transfection efficiency and an increase in the total number of surviving transfected cells. By combining this reverse transfection with a three-plasmid poly-transfection involving simple fluorescent reporters, an expanded potential to screen NA ratios with high transfection efficiency is demonstrated.

Autor im Rampenlicht: Fortschritte bei synthetischen genetischen Geräten für die Manipulation des Schicksals von Stammzellen und die Entwicklung von Zelltherapien

Eine optimierte Reverse-Poly-Transfektionstechnik auf Basis embryonaler Stammzellen der Maus zur schnellen Erforschung von Nukleinsäureverhältnissen

Our work generally focuses on using synthetic genetic devices to manipulate stem cell fate and behavior. By controlling cellular states, we aim to advance the development of next generation cellular therapies. Recently, a deeper understanding of the relationship between the dosage of a fate determining gene and the cell's lineage has been established.This was facilitated by the development of genetic controllers that are able to titrate a given gene precisely. Classic molecular biology techniques such as transfection or lentiviral transduction for simple gene over expression will always be a mainstay. However, our field has recently adopted synthetic devices that incorporate linear and non-linear feedback in order to obtain more complex outputs from delivered DNA.Gene dosage has a key role in determining the outcome of gene expression. When delivering multiple exogenous genes, a key experimental factor is how much of each gene will give the optimal or desired outcome. Our protocol allows researchers to rapidly scan across dosages in a single treatment, looking for the desired ratio of DNA devices.

Sowohl Vorwärts- als auch Rückwärtstransfektionen beruhen auf der Wechselwirkung zwischen der Zellmembran und den eingehenden Transfektionsreagenz-DNA-Komplexen, die die Abgabe von NA an die Empfängerzellen ermöglichen. Wo sich diese Techniken unterscheiden, ist der Zustand der Zelle bei der Abgabe - während die DNA in der Regel bei der traditionellen Vorwärtstransfektion an adhärente Zellmonoschichten abgegeben wird, beruht die umgekehrte Transfektion stattdessen darauf, dass der Reagenz-DNA-Komplex in einer Ein...

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Das vorliegende Protokoll beschreibt ein Verfahren zur umgekehrten Polytransfektion von embryonalen Stammzellen der Maus während der Kultur mit 2i- und LIF-Medien. Diese Methode bietet eine höhere Durchführbarkeit und Effizienz als herkömmliche Vorwärtstransfektionsprotokolle und ermöglicht gleichzeitig eine Ein-Topf-Optimierung der Plasmidverhältnisse.

Due to its relative simplicity and ease of use, transient transfection of mammalian cell lines with nucleic acids has become a mainstay in biomedical ...

Unsere Arbeit konzentriert sich im Allgemeinen auf die Verwendung synthetischer genetischer Geräte zur Manipulation des Schicksals und Verhaltens von Stammzellen. Durch die Kontrolle zellulärer Zustände wollen wir die Entwicklung von Zelltherapien der nächsten Generation vorantreiben. In jüngster Zeit wurde ein tieferes Verständnis des Zusammenhangs zwischen der Dosierung eines schicksalsbestimmenden Gens und der Abstammung der Zelle etabliert.Erleichtert wurde dies durch die Entwicklung genetischer Controller, die in der Lage sind, ein bestimmtes Gen präzise zu titrieren. Klassische molekularbiologische Techniken wie Transfektion oder lentivirale Transduktion zur einfachen Genüberexpression werden immer eine tragende Säule sein. Unser Fachgebiet hat jedoch kürzlich synthetische Geräte eingeführt, die lineares und nichtlineares Feedback enthalten, um komplexere Ergebnisse aus der gelieferten DNA zu erhalten.Die Gendosis spielt eine Schlüsselrolle bei der Bestimmung des Ergebnisses der Genexpression. Bei der Verabreichung mehrerer exogener Gene ist ein wichtiger experimenteller Faktor, wie viel von jedem Gen das optimale oder gewünschte Ergebnis liefert. Unser Protokoll ermöglicht es Forschern, in einer einzigen Behandlung schnell über Dosierungen hinweg zu scannen und nach dem gewünschten Verhältnis von DNA-Geräten zu suchen.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An Optimized Mouse Embryonic Stem Cell Based Reverse Poly-Transfection Technique for Rapid Exploration of Nucleic Acid Ratios

692 Aufrufe.  University of British Columbia. Unsere Arbeit konzentriert sich im Allgemeinen auf die Verwendung synthetischer genetischer Geräte zur Manipulation des Schicksals und Verhaltens von Stammzellen. Durch die Kontrolle zellulärer Zustände wollen wir die Entwicklung von Zelltherapien der nächsten Generation vorantreiben. In jüngster Zeit wurde ein tieferes Verständnis des Zusammenhangs zwischen der Dosierung eines schicksalsbestimmenden Gens und der Abstammung der Zelle etabliert.Erleichtert wurde dies durch die Ent...

Serie: Autor im Rampenlicht: Fortschritte bei synthetischen genetischen Geräten für die Manipulation des Schicksals von Stammzellen und die Entwicklung von Zelltherapien

Due to its relative simplicity and ease of use, transient transfection of mammalian cell lines with nucleic acids has become a mainstay in biomedical research. While most widely used cell lines have robust protocols for transfection in adherent two-dimensional culture, these protocols often do not translate well to less-studied lines or those with atypical, hard-to-transfect morphologies. Using mouse pluripotent stem cells grown in 2i/LIF media, a widely used culture model for regenerative medicine, this method outlines an optimized, rapid reverse transfection protocol capable of achieving higher transfection efficiency. Leveraging this protocol, a three-plasmid poly-transfection is performed, taking advantage of the higher-than-normal efficiency in plasmid delivery to study an expanded range of plasmid stoichiometry. This reverse poly-transfection protocol allows for a one-pot experimental method, enabling users to optimize plasmid ratios in a single well, rather than across several co-transfections. By facilitating the rapid exploration of the effect of DNA stoichiometry on the overall function of delivered genetic circuits, this protocol minimizes the time and cost of embryonic stem cell transfection.

The present protocol describes a method for reverse poly-transfection of mouse embryonic stem cells during culture with 2i and LIF media. This method yields higher viability and efficiency than traditional forward transfection protocols, while also enabling one-pot optimization of plasmid ratios.

Forschung

Entwicklungsbiologie

Preparation of Mouse Pluripotent Stem Cells &#40;mPSCs&#41; for Transfection

To prepare a gelatin coated 24 well plate add 200 microliters of the 0.2%gelatin solution to each well. Gently shake the plate to evenly spread the solution and allow the wells to coat at room temperature. After 15 minutes, using a vacuum aspirator carefully remove any leftover gelatin from the wells.Add 0.5 milliliters of freshly prepared NBIL media to each well. And place the plate in a tissue culture incubator to prewarm. Aliquot 30 milliliters of wash media into a 50 milliliter conical tube.Aspirate the media from the tissue culture dish of mESCs and add required amount of cell detachment medium. After three to five minutes, pipette up and down 15 to 20 times using a P1, 000 pipette. Observe the cells under a microscope.To ensure a single cell suspension transfer the cell suspension into a 50 milliliter tube containing wash media. Centrifuge the suspension at 300G for five minutes at room temperature and aspirate the wash media. Resuspend the pellet in approximately 300 microliters of wash media.

Vorbereitung von pluripotenten Stammzellen der Maus (mPSCs) für die Transfektion

Reverse and Forward Transfection of Mouse Pluripotent Stem Cells &#40;mPSCs&#41;

To begin, aliquot 200 microliters of NBIL media into 1.5 milliliter tubes. Add 26 microliters of the optimum transfection reagent mixture to the DNA optimum mixture. Pipe at the reagents vigorously approximately 10 times.Transfer the required volume of mPSC suspensions to the 200 microliters of NBIL tubes. Then add lipofectamine 2000 and DNA mixture to the tubes and mix well by pipetting. After five minutes, centrifuge the mixture at 300 G for five minutes and remove the supernatant, leaving approximately 50 microliters in the tube.Re suspend the pellet in 100 microliters of NBIL media. Transfer the cell suspension to a gelatin-coated 24-well plate and place plate in the incubator. Transfer the required volume of mPSC suspension to seed 25, 000 cells per well of a gelatin coated 24-well plate and place the plate in the incubator.One hour prior to transfection. Replace the media from the wells with 0.5 milliliters of NBIL media. After incubation, dropwise, add lipofectamine 2000 and DNA mixture to the wells.Place the plate in the incubator for 48 hours.

Rückwärts- und Vorwärtstransfektion von pluripotenten Stammzellen (mPSCs) der Maus

Flow Cytometry Analysis of Transfected Mouse Pluripotent Stem Cells &#40;mPSCs&#41;

After transfection of mPSCs, aspirate the media from the six-well plate. Then add 200 microliters of trypsin into each well. Swirl and incubate for 30 seconds at 37 degrees Celsius.Tap the side of the plate and add 200 microliters of ice cold FACS buffer. Using a P200 pipette, mix the contents of each well to dislodge cells and make single cell solutions. Transfer 200 microliters from each well to the appropriate well on the 96-well plate Centrifuge the plate at 300 G for five minutes.After centrifugation, resuspend the pellets in 150 microliters of FACS buffer before running the sample on a flow cytometer. Compared to reverse transfections, forward transections showed a significantly lower proportion of cells positive for the marker. Interestingly, forward Transfect did not deliver a significantly lower amount of DNA on average to the population of cells.In reverse transections, incubation time significantly influenced the percentage of reporter positive cells. However, the average reporter expression in positive cells was not affected by incubation time. For both poly and co-transfection, a forward transfection significantly decreased the number of cells present at the chosen endpoint compared to reverse transfections.In the case of reverse poly-transections, higher transfection efficiency and a broader dynamic range of well-represented DNA ratios were observed.