1. Vorbereitung der Transplantation Epithel Frisches oder tiefgekühltes Spender Epithelgewebe lassen sich in den geräumten Fettpolster transplantiert werden, aber vor Zubereitung von Tiefkühl-Spender Epithel ist bequemer mit einem minimalen Rückgang der Transplantation Wirkungsgrad (&gt; 85% Wirkungsgrad). Das Protokoll für die Zubereitung von Tiefkühl-Spender Epithel ist wie folgt: Vor der Zubereitung Spenders zu transplantieren Epithel, bereiten einfrieren Medien für Epithel und aliquoten etwa 1ml in Kryoröhrchen. Dies kann bei 4 ° C gelagert werden für bis zu 6 Monate, bis sie benötigt. Freeze-Medium enthält DMEM/F12 Medien mit HEPES und NaHCO 3, 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 10% Dimethylsulfoxid (DMSO) gepuffert. Ernte Mamma Epithel aus einer kürzlich eingeschläfert weiblichen Maus. <ol><li> Waschen Sie die Maus mit 70% EtOH. </li><li> Machen Sie eine Mid-sagittal geschnitten durch den Körper Wand, die sich vom Schambein bis zum Brustbein ohne Durchstechen der serösen Häute des ventralen Leibeshöhle. Machen Sie einen schrägen Schnitt aus dem ersten Schnitt am Schambein aufeinander Hinterbein (Abbildung 1). </li><li> Peel die Wand des Körpers weg von der serösen Häute, die 5 th inguinal Brustdrüse an der Faszie an der Unterseite des Körpers Wand freizulegen. Der beste Weg, um dies zu erreichen wird durch Ergreifen der serösen Häute sorgfältig mit dem gekrümmten Teil eines Paares von einer gebogenen Pinzette, man aufpassen, nicht zu durchbohren der ventralen Leibeshöhle. Gleichzeitig greifen die Schnittkante der Haut mit geraden gezackten Zange und ziehen den Körper Wand weg von der serösen Häute. </li><li> Identifizieren Sie die Lymphknoten in der Brustdrüse. Die Lymphknoten an der Kreuzung von drei prominenten Blutgefäße in der Brustdrüse und kann als eine dichte Knoten innerhalb der Fettpolster (Abbildung 2) zu spüren sein. Mit der Spitze ein Paar Augen Scheren, nip das Fettgewebe um den Knoten. Mit einem Zeigefinger auf der epidermalen Seite der Haut, Druck auf die Knoten aus dem Fettpolster erhöhen und eine Prise Sie ihn mit einem Paar von gebogenen Pinzette. Entsorgen Sie die Lymphknoten. </li><li> Halten Sie die Ränder der Haut, fassen Sie das Brustfettpolster mit dem gekrümmten Rand aus einem Paar von gebogenen Pinzette und allmählich schälen Fettpolster vom Körper weg Wand. Folgen Sie die Richtung der Fettpolster auf der dorsalen Oberfläche der Maus, während Sie die gesamte Brustdrüse entfernt in einem Stück. </li><li> Legen Sie die Brustdrüse auf einer sterilen Plastik Schneidblock. Fügen Sie eine kleine Menge von Medien, etwa 200 ul, an die Oberfläche der Drüse zu halten sie feucht. Mince der Drüse in 1mm Stück mit einer frischen Rasierklinge. Teilen Sie die zerkleinerten Drüse in vier Portionen und verteilen unter vier Kryoröhrchen von freeze Medien mit einer Pinzette. Legen Sie die Kryoröhrchen in einem Nalgene &quot;Mr. Frosty Zelle Gefrierschrank, die 250 ml Isopropylalkohol wurde in der äußeren Kammer. Legen Sie die Nalgene Gefrierschrank in einem -70 ° C Gefrierschrank für 24 Stunden. Shop eingefroren Fläschchen Milch-Fragmente in flüssigem Stickstoff bis zur erforderlichen Transplantation. Jeder Kryoröhrchen enthält genug Brustdrüse Fragmente in den geräumten Fettpolster 4 bis 8 Host-Mäusen zu transplantieren. </li></ol> 2. Vorbereitung der Transplantation Cells Unser Labor hat verschiedene Zelltypen, darunter verewigt Brustepithelzellen Zelllinien, Brusttumor-Zelllinien oder primären Mamma-Zellen in einer Maus gelöscht Fettpolster transplantiert. Das Protokoll für die Herstellung von Comma-D-Zellen für die Transplantation ist wie folgt: <ol><li> Comma-D-Zellen sind in regelmäßigen MECL Medien mit DMEM: F12 mit 2% Serum ausgewachsener Rinder (ABS), mEGF, Insulin, Antibiotika / Antimykotika (AB / AM) ergänzt. </li><li> Ernte Comma-D-Zellen, wenn die Zellen 85% -90% konfluent sind. </li><li> Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 1200rpm für 5 Minuten die Zellen zu pelletieren. Resuspendieren der Zellen in frischem MECL Medien und passen Sie die Zelle eine Konzentration von 5 x 10 6 / ml. </li></ol> Für die Transplantation von primären Mamma-Zellen, sind die primären Brustepithelzellen von Maus 5 th Milchdrüsen durch mechanische und enzymatische Dissoziation isoliert. Die Zellen werden in DMEM resuspendiert: F12 Medien und angepasst, um die gewünschte Konzentration, in der Regel 5 x 10 6 / ml. 3. Standard-Verfahren für das Clearing der Maus Brustfettpolster <ol><li> Anesthetize die drei Wochen alte Host-Maus. Wählen Mäuse, &lt;12 g, um sicherzustellen, dass Mamma duktales Wachstum nicht eingeleitet worden sind. Wir verwenden 200mg/kg Körpergewicht von 2,2,2-Tribromethanol. </li><li> Nach der Maus betäubt, fest begrenze die Maus, Bauchseite mit Gliedmaßen ausgestreckt, auf einer chirurgischen Stadium, so dass der Bauch ist verhöhnen. Vor der Operation, Administration Analgetika, entweder Bupivacain (&lt;1mg/kg) oder Buprenorphin (0.05mg/kg), subkutan. </li><li> Fassen Sie die Haut mit einer Pinzette ein paar Millimeter über dem Becken und heben Sie sie aus dem Bauch<html> . Nip die Haut mit einer Schere und einem mittleren sagittalen Schnitt durch den Körper Wand, die sich vom Schambein bis zum Brustbein zu machen. Nicht gewaltsam öffnen die serösen Häute der ventralen Leibeshöhle. Machen Sie nicht Ihre erste Schnitt zu nahe an der Harnröhre in der Nähe, so dass Wundklammern wird nicht mit der Maus in der Lage zu urinieren stören. </li><li> Von der ersten Schnitt machen schräge Schnitte durch die Haut ab Mitte der Linie quer über das Becken in Richtung jedes Hinterbein. </li><li> Verwenden Sie den gekrümmten Bereich der gebogenen Pinzette vorsichtig greifen die serösen Häute. Verwenden Gewebe Zange, um den Schnitt-Marge der Haut fassen und ziehen den Körper Wand weg von der serösen Häute und setzen die 5 th inguinal Brustdrüse auf der Faszie an der Unterseite des Körpers Wand. </li><li> Cauterize der Brustwarze, Knoten und zwei Arterien, die den Knoten (Abbildung 2) </li><li> Trennen Sie die vierte und fünfte Drüsen. Cauterize den Rand des fünften Drüse Einwachsen aus dem 6. Drüse zu verhindern. </li><li> Teilen Sie die Fettpolster des vierten Brustdrüse, indem über die Fettpolster mit einer Schere nur ventral (Seite in Richtung Brustwarze) des Knotens. Verwenden einer gebogenen Pinzette fest zu fassen ventralen Teil der Fettpolster an und ziehen Sie weg vom Körper Wand in einem Stück. Drücken Sie die ventralen Teil der Fettpolster zwischen zwei Folien und in ein Glas Histologie Färbung Schale mit Carnoy Fixativ. Dieses Gewebe wird fixiert und später mit Carmin Alaun-Lösung angefärbt, um gelöscht Margen (Abbildung 3) zu überprüfen. Reinigen Sie die Blende rund um die Region des entfernten Teil der Fettpolster, um alle Spuren der Brustdrüse mit einer gebogenen Pinzette entfernen. </li></ol> 4. Alternative &quot;Sparing Vorgehensweise für Clearing the Fat Pad Nach einem geworden ist mit dem Standard-Verfahren für das Clearing der Maus Brustfettpolster kompetent, können sie es vorziehen, die weniger invasive schonende Verfahren von Brill et al. (2008) 2 entwickelt Versuch. <ol><li> Bereiten Sie die Maus als für die Standard-Prozedur. </li><li> Fassen Sie den Nippel des vierten inguinal Brustdrüse und schneiden Sie ein 3-5 mm Umfang Kreis rund um die Brustwarze mit der Spitze der Schere. </li><li> Ziehen Sie die Brustwarze vom Körper weg, um den Schnitt Abschnitt der Haut lösen und ziehen die vierte inguinal Brustdrüse durch das Loch. </li><li> Identifizieren Sie die Knoten. Verwenden Sie das Brenneisen, um den Knoten und die 6 th Brustdrüse durch das Loch cauterize. </li><li> Cut und lösen Sie den oberflächlichsten Teil der 5 th Brustdrüse kurz vor dem Knoten. Die Brustwarze, kreisförmige Fläche von Haut und Teil des Brustfettpolster mit Epithel sind in einem Stück entfernt. </li></ol> 5. Tissue / Cell Transplantation <ol><li> Für die Transplantation Epithel-Fragmente, Abtauung ein Kryoröhrchen von Epithel und den Transfer der epithelialen Fragmente in eine Petrischale mit frischem Medium zu verwässern die DMSO. Machen Sie ein kleines Loch oder Tasche in den geräumten Fettpolster mit Schere Spitze für das neue Epithel. Setzen Sie einen 1mm Stück Spender Epithel in die Tasche mit Nadel Pinzette. Halten Sie die Tasche mit dem Gewebe Zange geschlossen, wie Sie die Nadel Zange zurückziehen, so das Gewebe bleibt bestehen. </li><li> Für Transplantation von Zellen, injiziert 50.000 Zellen in 10 ul Medien in jedes Fettpolster mit einem 50 ul Hamilton-Spritze mit einem 22s-Gauge-Nadel. </li></ol> 6. Closing / Revival der Maus <ol><li> Ordnen Sie die Haut für die Schließung. Fassen gegnerischen Rande der Haut, halten sie zusammen mit einer Pinzette, heben sie sich von den serösen Häuten der ventralen Leibeshöhle und schließen mit Wundklammern. In der Regel ist es notwendig, zwei Klammern verwenden, um die Mitte des sagittalen Schnittführung und ein Clip für jeden Schrägschnitt für den Standard-Verfahren zu schließen. Vermeiden Sie behindern die Harnröhre. Es kann notwendig sein, um Lücken in der Haut nahe am Schnittpunkt der Mitte der sagittalen und schrägen Schnitten mit einer Naht. Der sparsame Verfahren benötigen nur eine Wunde Clip für jede Seite. </li><li> . Platzieren Sie die Maus in ihrem Käfig und halten den Käfig unter eine Wärmelampe, bis die Maus wieder belebt hat. </li><li> Die Wunde Clips sollte nach 2 Wochen entfernt werden. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Demonstration der Schnitt-Muster. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Lage der Lymphknoten, Blutgefäße, Nippel und endogenen Epithel. Cauterize an Orten angezeigt. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Whole mount zeigt, dass endogene Epithel auf den Bereich innerhalb des Kreises beschränkt und damit die Margen sind &quot;klar&quot;. 7. Repräsentative Ergebnisse _r.jpg &quot;alt =&quot; Bild 4 &quot;/&gt; Abbildung 4. Whole mount von entfernt Fettpolster ab 3 Wochen alten Maus, welche gelöscht Margen. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig2_r.jpg" alt="Abbildung 5" /> Abbildung 5. Whole mount von einem 10 Wochen alten Maus, welche Fettpolster des endogenen Mamma Epithel gelöscht. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig3_r.jpg" alt="Abbildung 6" /> Abbildung 6. Hämatoxylin und Eosin gefärbt Abschnitt eines gelöscht Fettpolster von einem 10 Wochen alten Maus. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig4_r.jpg" alt="Abbildung 7" /> Abbildung 7. Whole mount von einem 10 Wochen alten Maus zeigt normale Mamma duktalen Baum verpflanzt Epithel entwickelt. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig5_r.jpg" alt="Abbildung 8" /> Abbildung 8. Hämatoxylin und Eosin gefärbt Abschnitt Milchgänge von transplantierten Epithel entwickelt. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig6_r.jpg" alt="Abbildung 9" /> Abbildung 9. Hämatoxylin und Eosin gefärbt Abschnitt einer Brusttumor von transplantierten Epithel entwickelt.

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	<li>DeOme, K. B., Faulkin, L. J., Bern, H. A., Blair, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+mammary+tumors+from+hyperplastic+alveolar+nodules+transplanted+into+gland-free+mammary+fat+pads+of+female+C3H+mice.">Development of mammary tumors from hyperplastic alveolar nodules transplanted into gland-free mammary fat pads of female C3H mice.</a> Cancer Res. 19, 515-520 (1959).</li><li>Brill, B., Boecher, N., Groner, B., Shemanko, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sparing+procedure+to+clear+the+mouse+mammary+fat+pad+of+epithelial+components+for+transplantation+analysis.">A sparing procedure to clear the mouse mammary fat pad of epithelial components for transplantation analysis.</a> Laboratory Animals. 42, 104-110 (2008).</li><li>Jerry, D. J., Kittrell, F. S., Kuperwasser, C., Laucirica, R., Dickinson, E. S., Bonilla, P. J., Butel, J. S., Medina, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mammary-specific+model+demonstrates+the+role+of+the+p53+tumor+suppressor+gene+in+tumor+development.">A mammary-specific model demonstrates the role of the p53 tumor suppressor gene in tumor development.</a> Oncogene. 19, 1052-1058 (2000).</li><li>Shackleton, M., Vaillant, F., Simpson, K. J., Stingl, J., Smyth, G. K., Asselin-Labat, M. -. L., Wu, L., Lindman, G. J., Visvader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+functional+mammary+gland+from+a+single+stem+cell.">Generation of a functional mammary gland from a single stem cell.</a> Nature. 439, 84-88 (2006).</li><li>Stingl, J., Eirew, P., Ricketson, I., Shackleton, M., Vaillant, F., Choi, D., Li, H. I., Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+unique+properties+of+mammary+epithelial+stem+cells.">Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells.</a> Nature. 439, 993-997 (2006).</li><li>Medina, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preneoplastic+Lesions+in+Murine+Mammary+Cancer.">Preneoplastic Lesions in Murine Mammary Cancer.</a> Cancer Res. 36, 2589-2595 (1976).</li><li>Wagner, K. -. U., Boulanger, C. A., Henry, S. g. a. g. i. a. s., Hennighausen, M., Smith, G. H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+adjunct+mammary+epithelial+cell+population+in+parous+females:+its+role+in+functional+adaptation+and+tissue+renewal.">An adjunct mammary epithelial cell population in parous females: its role in functional adaptation and tissue renewal.</a> Development. 129, 1377-1386 (2002).</li><li>Dunphy, K. A., Blackburn, A. C., Haoheng, Y., O Connell, L. R., Jerry, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+and+progesterone+induce+persistent+increases+in+p53-dependent+apoptosis+and+suppress+mammary+tumors+in+BALB/c-Trp53+/-+mice.">Estrogen and progesterone induce persistent increases in p53-dependent apoptosis and suppress mammary tumors in BALB/c-Trp53+/- mice.</a> Breast Cancer Res. 10 (3), R43-R43 (2008).</li></ol>

In diesem Bericht stellen wir zwei alternative Methoden zum Löschen der Maus Brustfettpolster in Vorbereitung Brustepithelzellen Transplantationen. Die Standard-Verfahren wird seit seiner Entwicklung 1959 von DeOme et al. 1 Während mehr invasive, ist die Standard-Methode die bevorzugte Methode für das Training der Anfänger, weil die Struktur und Ausrichtung der Brustdrüse leicht betrachtet werden. Allerdings kann die schonende Verfahren durch den erfahrenen Chirurgen, weil mehrere Vorteile ...

mammary epithelial transplant procedure

Dieser Artikel beschreibt und vergleicht die Fettpolster Genehmigungsverfahren durch DeOme KB et al. 1 und die schonende Verfahren Brill B et al. 2, gefolgt von der Brustepithelzellen Transplantation. Die Mamma-Transplantation wird häufig von Mamma Biologen verwendet, weil es nutzt die Tatsache, dass bedeutende Entwicklung der Milch-Epithel nicht bis nach der Pubertät auftreten. Am Alter von 3 Wochen wird das Wachstum der Brustepithelzellen Baum bis in die Nähe der Brustwarze beschränkt und das Fettpolster ist weitgehend frei von Mamma-Epithel, sondern durch Alter von 7 Wochen der epithelialen duktalen Baum erstreckt sich über die gesamte Fettpolster. Deshalb, wenn diese kleiner Teil der Fettpolster mit Epithel, die Region zwischen die Brustwarze und den Lymphknoten, im Alter von 3 Wochen entfernt wird, wird die endogene Epithel nie bevölkern die Brustfettpolster und die Fettpolster als &quot;cleared beschrieben &quot;. Zu diesem Zeitpunkt kann Mamma Epithel aus einer anderen Quelle in den geräumten Fettpolster, wo es das Potenzial hat, Mamma-duktales Bäume durch die Fettpolster zu erweitern transplantiert werden. Dieses Verfahren wurde in vielen experimentellen Modellen einschließlich der Prüfung von Tumor-Phänotyp in transgenen Brustepithelzellen Gewebe ohne die verwirrende Wirkung des Genotyps auf das gesamte Tier 3 verwendet worden, bei der Identifizierung von Mamma-Stammzellen durch die Transplantation von Zellen in limitierter Verdünnung 4,5, Bestimmung wenn hyperplastische Knötchen an Mammatumoren vor 6 und um die Wirkung der vor Hormon-Exposition auf das Verhalten der Milch-Epithel 7,8 zu bewerten. Drei Wochen alte Host-Mäuse sind betäubt, gereinigt und zurückhaltend auf einer chirurgischen Bühne. Ein mittsagittale Schnitt durch die Haut, aber nicht das Bauchfell, die sich vom Schambein bis zum Brustbein. Schrägschnitte werden durch die Haut aus der Mitte des sagittalen Schnitt über dem Becken in Richtung jedem Bein. Die Haut wird vom Peritoneum bis zum 4. inguinal Brustdrüse freizulegen. Die Fettpolster wird durch Entfernen der Fettpolster Gewebe anterior der Lymphknoten gelöscht. Epithel-Fragmente oder Epithelzellen sind in den verbleibenden gelöscht Fettpolster transplantiert und die Maus ist geschlossen.

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Mammary Epithelial Transplant Procedure

Dieser Artikel veranschaulicht das Verfahren, nach DeOme KB entwickelt<em&gt; Et al.</em&gt; (1959) und den schonenden Verfahren von Brill B entwickelt<em&gt; Et al.</em&gt; (2008) für das Clearing der 4. inguinal Brustfettpolster eines pubertierenden Maus in Vorbereitung auf die Transplantation von Mamma-Fragmente, Brustepithelzellen oder Mamma-Tumorzellen.

Brustepithelzellen Transplantation

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, ...

Research

JoVE Journal

Biology

30.9K Aufrufe.  University of Massachussetts. Dieser Artikel veranschaulicht das Verfahren, nach DeOme KB entwickelt Et al. (1959) und den schonenden Verfahren von Brill B entwickelt Et al. (2008) für das Clearing der 4. inguinal Brustfettpolster eines pubertierenden Maus in Vorbereitung auf die Transplantation von Mamma-Fragmente, Brustepithelzellen oder Mamma-Tumorzellen.

Serie: Mammary Epithelial Transplant Procedure

Investigating the Immunological Mechanisms Underlying Organ Transplant Rejection

Die Untersuchung der immunologischen Mechanismen Organtransplantatabstoßung

Forschung

Biologie

Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of dome shaped cell structures referred to as mammospheres 1. The HC11 cell line has been employed as a model system for the study of regulation of mammary lactogenic differentiation both in vitro and in vivo 2. The HC11 cells differentiate and synthesize milk proteins in response to treatment with lactogenic hormones. Following the growth of HC11 mouse mammary epithelial cells to confluence, lactogenic differentiation was induced by the addition of a combination of lactogenic hormones including dexamethasone, insulin, and prolactin, referred to as DIP. The HC11 cells induced to differentiate were photographed at times up to 120 hours post induction of differentiation and the number of mammospheres that appeared in each culture was enumerated. The size of the individual mammospheres correlates with the degree of differentiation and this is depicted in the images of the differentiating cells.

HC11 lactogenic differentiation can be characterized by the formation of domed structures referred to as mammospheres. The structures can be enumerated by phase contrast microscopy to aid in quantifying lactogenic differentiation.

Maus Brustepithelzellen Form Mammospheres Während lactogenic Differenzierung

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of ...

Dendra2 Photoswitching through the Mammary Imaging Window

In the last decade, intravital microscopy of breast tumors in mice and rats at single-cell resolution1-4 has resulted in important insights into mechanisms of metastatic behavior such as migration, invasion and intravasation of tumor cells5, 6, angiogenesis3 and immune cells response7-9. We have recently reported a technique to image orthotopic mammary carcinomas over multiple intravital imaging sessions in living mice10. For this, we have developed a Mammary Imaging Window (MIW) and optimized imaging parameters for Dendra211 photoswitching and imaging in vivo. Here, we describe the protocol for the manufacturing of MIW, insertion of the MIW on top of a tumor and imaging of the Dendra2- labeled tumor cells using a custom built imaging box. This protocol can be used to image the metastatic behavior of tumor cells in distinct microenvironments in tumors and allows for long term imaging of blood vessels, tumor cells and host cells.

Intravital photoswitching and tracking of Dendra2-labeled tumor cells through the Mammary Imaging Window is a technique which allows us to image the metastatic behavior of tumor cells in chosen tumor microenvironments over a timescale of days.

Dendra2 Photoschalten durch die Mammary Imaging Fenster

In the last decade, intravital microscopy of breast tumors in mice and rats at single-cell resolution1-4  has resulted in important insights into ...

Right Hemihepatectomy by Suprahilar Intrahepatic Transection of the Right Hemipedicle using a Vascular Stapler

Successful hepatic resection requires profound anatomical knowledge and delicate surgical technique. Hemihepatectomies are mostly performed after preparing the extrahepatic hilar structures within the hepatoduodenal ligament, even in benign tumours or liver metastasis.1-5. Regional extrahepatic lymphadenectomy is an oncological standard in hilar cholangiocarcinoma, intrahepatic cholangio-cellular carcinoma and hepatocellular carcinoma, whereas lymph node metastases in the hepatic hilus in patients with liver metastasis are rarely occult. Major disadvantages of these procedures are the complex preparation of the hilus with the risk of injuring contralateral structures and the possibility of bleeding from portal vein side-branches or impaired perfusion of bile ducts. We developed a technique of right hemihepatectomy or resection of the left lateral segments with intrahepatic transection of the pedicle that leaves the hepatoduodenal ligament completely untouched. 6 However, if intraoperative visualization or palpation of the ligament is suspicious for tumor infiltration or lymph node metastasis, the hilus should be explored and a lymphadenectomy performed.

This video describes a right hemihepatectomy with intrahepatic transection of the right hemipedicle leaving the hepatoduodenal ligament completely untouched.

Rechts Hemihepatektomie durch Suprahilar intrahepatische Durchtrennung des rechten Hemipedicle mit einem Vascular Stapler

Successful hepatic resection requires profound anatomical knowledge and delicate surgical technique. Hemihepatectomies are mostly performed after ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development of a larger region of the embryo. This makes defining its role in a particular tissue difficult to analyze. For example, noggin overexpression in Xenopus laevis embryos causes the expansion of the entire anterior region, including the eye1,2. From this result, it is not known if Noggin plays a direct role in eye determination or that by causing an expansion of neural tissue, Noggin indirectly affects eye formation. Having this complex phenotype makes studying its eye-specific role in cell fate determination difficult to analyze. We have developed an assay that overcomes this problem. Taking advantage of the pluripotent nature of the Xenopus laevis animal cap 3, we have developed an assay to test the ability of gene product(s), like noggin or the eye field transcription factors (EFTFs), to transform caps into particular tissue or cell types by transplanting this tissue onto the side of the embryo 4. While we have found either Noggin protein treatment or a collection of transcription factors can determine retinal cell fate in animal caps, this procedure could be used to identify gene product(s) involved in specifying other tissues as well.

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Animal caps overexpressing gene product(s) are transplanted to the flank of developing Xenopus laevis embryos in order to establish whether tissue is determined.

Tissue Bestimmung mit dem Tier Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves composed of a number of terminal duct lobular units made of secretory alveoli and converging ducts1. In mice, a similar architecture is observed at pregnancy in which ducts and alveoli are interspersed within the connective tissue stroma. The mouse mammary gland epithelium is a tree like system of ducts composed of two layers of cells, an inner layer of luminal cells surrounded by an outer layer of myoepithelial cells denoted by the confines of a basement membrane2. At birth, only a rudimental ductal tree is present, composed of a primary duct and 15-20 branches. Branch elongation and amplification start at the beginning of puberty, around 4 weeks old, under the influence of hormones3,4,5. At 10 weeks, most of the stroma is invaded by a complex system of ducts that will undergo cycles of branching and regression in each estrous cycle until pregnancy2. At the onset of pregnancy, a second phase of development begins, with the proliferation and differentiation of the epithelium to form grape-shaped milk secretory structures called alveoli6,7. Following parturition and throughout lactation, milk is produced by luminal secretory cells and stored within the lumen of alveoli. Oxytocin release, stimulated by a neural reflex induced by suckling of pups, induces synchronized contractions of the myoepithelial cells around the alveoli and along the ducts, allowing milk to be transported through the ducts to the nipple where it becomes available to the pups 8. Mammary gland development, differentiation and function are tightly orchestrated and require, not only interactions between the stroma and the epithelium, but also between myoepithelial and luminal cells within the epithelium9,10,11. Thereby, mutations in many genes implicated in these interactions may impair either ductal elongation during puberty or alveoli formation during early pregnancy, differentiation during late pregnancy and secretory activation leading to lactation12,13. In this article, we describe how to dissect mouse mammary glands and assess their development using whole mounts. We also demonstrate how to evaluate myoepithelial contractions and milk ejection using an ex-vivo oxytocin-based functional assay. The effect of a gene mutation on mammary gland development and function can thus be determined in situ by performing these two techniques in mutant and wild-type control mice.

This method describes how to dissect and assess mammary gland development and function from mice. Excised mammary glands are assessed for the degree of development using whole mount while milk ejection is evaluated using an oxytocin-based myoepithelial cell contraction assay.

Evaluation der Brustdrüse Entwicklung und Funktion in Mausmodellen

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves ...

Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work has been done using classical two-dimensional cell culture models, which allow for easy cell manipulation. It has become clear that intracellular signaling pathways are affected by extracellular forces, including dimensionality and cell surface tension3-4. Multiple approaches have been taken to develop three-dimensional models that more accurately represent biologic tissue architecture3. While these models incorporate multi-dimensionality and architectural stresses, study of the consequent effects on cells is less facile than in two-dimensional tissue culture due to the limitations of the models and the difficulty in extracting cells for subsequent analysis.
The important role of the microenvironment around tumors in tumorigenesis and tumor behavior is becoming increasingly recognized4. Tumor stroma is composed of multiple cell types and extracellular molecules. During tumor development there are bidirectional signals between tumor cells and stromal cells5. Although some factors participating in tumor-stroma co-evolution have been identified, there is still a need to develop simple techniques to systematically identify and study the full array of these signals6. Fibroblasts are the most abundant cell type in normal or tumor-associated stromal tissues, and contribute to deposition and maintenance of basement membrane and paracrine growth factors7.
Many groups have used three dimensional culture systems to study the role of fibroblasts on various cellular functions, including tumor response to therapies, recruitment of immune cells, signaling molecules, proliferation, apoptosis, angiogenesis, and invasion8-15. We have optimized a simple method for assessing the effects of mammary fibroblasts on mammary epithelial cells using a commercially available extracellular matrix model to create three-dimensional cultures of mixed cell populations (co-cultures)16-22. With continued co-culture the cells form spheroids with the fibroblasts clustering in the interior and the epithelial cells largely on the exterior of the spheroids and forming multi-cellular projections into the matrix. Manipulation of the fibroblasts that leads to altered epithelial cell invasiveness can be readily quantified by changes in numbers and length of epithelial projections23. Furthermore, we have devised a method for isolating epithelial cells out of three-dimensional co-culture that facilitates analysis of the effects of fibroblast exposure on epithelial behavior. We have found that the effects of co-culture persist for weeks after epithelial cell isolation, permitting ample time to perform multiple assays. This method is adaptable to cells of varying malignant potential and requires no specialized equipment. This technique allows for rapid evaluation of in vitro cell models under multiple conditions, and the corresponding results can be compared to in vivo animal tissue models as well as human tissue samples.

A simple method is described for analyzing effects of tissue fibroblasts on associated epithelial cells. The combination of this method and three-dimensional tissue culture can facilitate analysis of cells after isolation from 3D. The technique is applicable to cells of varying malignant potential, allowing systematic study of effects of tumor-associated stroma on tumor cells.

Isolierung von Brustepithelzellen aus dreidimensionalen Mixed-Zelle Spheroid Co-Kultur

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

Chromatin Isolierung von RNA-Reinigung (Chirp)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

Schnelle Genetische Analyse von epithelial-mesenchymale Signaling Während Haarregeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Cryosectioning Method for Microdissection of Murine Colonic Mucosa

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The colonic epithelium is dynamically turned over and epithelial cells are generated in the stem cell containing crypts of Lieberk&#252;hn. Progenitor cells produced in the crypt-bases migrate toward the luminal surface, undergoing a process of cellular differentiation before being shed into the gut lumen. In order to study these processes at the molecular level, we have developed a simple method for the microdissection of two spatially distinct regions of the colonic mucosa; the proliferative crypt zone, and the differentiated surface epithelial cells. Our objective is to isolate specific crypt and surface epithelial cell populations from mouse colonic mucosa for the isolation of RNA and protein.

Here we describe a simple method for the isolation of spatially distinct murine colonic epithelial surface cells from the underlying crypt-base cells.

Kryoschneiden Verfahren zur Mikrodissektion von Murine Kolonschleimhaut

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The ...