Die Synchronisierung von Drosophila zur Definition zirkadianer Zeiten ist der erste Schritt bei der Untersuchung von Ereignissen, die entweder die biologische Uhr steuern oder darauf reagieren. Die Synchronisierung aller Modelle folgt dem gleichen grundlegenden Ansatz. Es gibt viele Schritte, um dies praktisch zu tun, und es mag überwältigend erscheinen, sie alle zusammenzufassen.
Erwarten Sie, ein paar Mal zu versuchen, bevor es sich natürlich anfühlt. Halten Sie die Temperaturen stabil und ich möchte, dass das Licht während der drei Minuten Schritte aus. Bereiten Sie das Fliegenfutter in einem Crock-Pot bei 121 Grad Celsius vor und mischen Sie es als Zutaten.
Den Crock-Pot abdecken und den Inhalt zum Kochen bringen, den Inhalt alle 10 Minuten mischen. Nach 20 Minuten beim Kochen die Hitze abschalten und 83,6 Milliliter Wasser in den Crock-Pot geben. Lassen Sie den Deckel ab, wenn das Essen abkühlt.
Während das Essen abkühlt, rühren Sie es alle 10 Minuten, um zu vermeiden, dass sich ein Film auf der Oberseite bildet. Messen Sie auch die Temperatur alle 10 Minuten mit einem Glasthermometer. Sobald das Essen auf unter 60 Grad Celsius abgekühlt ist, fügen Sie Tegosept und Propionsäure hinzu, wie im Manuskript beschrieben.
Mischen Sie gut und passen Sie den Crock-Pot an eine Temperatur, nur ein paar Grad weniger als 60 Grad Celsius. Verwenden Sie eine peristaltische Pumpe, um die Fliegennahrung zu verteilen. Für schmale Fläschchen, pumpen 10 Milliliter, und für sechs Unzen quadratische neinige Bodenflaschen, Pumpen Sie 60 Milliliter.
Lagern Wildtyp fliegen bei 25 Grad Celsius für 10 bis 12 Tage, bis etwa 200 Welpen an der Innenseite der Flasche befestigt sind. Um die Erwachsenen aus der Flasche zu entfernen, kippen Sie sie in eine neue Flasche, und verwenden Sie das stumpfe Ende einer Zahl Null Pinsel, um alle verbleibenden Erwachsenen in schieben. Wischen Sie den Pinsel vor und nach Gebrauch mit 70% Ethanol ab.
Inkubieren Sie die Pupae bei 25 Grad Celsius, damit die nächste Generation entstehen kann. Nach drei Tagen werden die Fliegen null bis drei Tage alt sein. Denken Sie daran, dass Temperatur, Licht und sogar Ihre Wahl der Nahrung die Entrainment beeinflussen wird.
Achten Sie darauf, sie zu behalten, jede Kontrolle während Ihres Experiments. Verwenden Sie zu den angegebenen Zeitpunkten für die Sammlung ein Kohlendioxid-Anästhesiepad, um die Fliegen zu immobilisieren, und sammeln Sie 100 Männchen und 100 Weibchen. Weibliche Fliegen sind viel größer als Männchen.
Die Fliegen können auch durch die Untersuchung von Genitalien unterschieden werden. Männchen haben dunkel abgerundete Genitalien, während Weibchen hellere, spitzere Genitalien haben. Legen Sie Männchen und Weibchen in separate Fläschchen mit 100 Weibchen pro Durchstechflasche und 50 Männchen pro Durchstechflasche.
Männliche soziale Interaktionen führen zu vielen Todesfällen, wenn es 100 Personen in einer Durchstechflasche gibt. Um eine zirkadiane Verzierung zu ermöglichen, legen Sie die Fläschchen drei bis fünf Tage lang in lichtregulierte Inkubatoren. Um Fliegen für die zukünftige Ausbildung zu produzieren, platzieren Sie 25 der verbleibenden Weibchen und fünf bis sieben der verbleibenden Männchen in einer neuen Flasche.
Inkubieren Sie die Flasche bei 25 Grad Celsius. Für je 100 Fliegen, die gesammelt werden. Bereiten Sie eine schmale Durchstechflasche vor, indem Sie 4,8 Milliliter Fixativ hinzufügen.
Legen Sie die schmalen Fläschchen in einen Eimer Eis und nehmen Sie den Eimer, die Papiertücher, die Folie und das Klebeband zum Inkubator. Um die Fliegen zu sammeln, legen Sie einen Trichter in die schmale Durchstechflasche, entfernen Sie dann die Kappe aus der Fläschchen der Fliegen und kehren Sie sie schnell in den Trichter um. Tippen Sie sanft, um die Fliegen in die Durchstechflasche des Fixativs zu führen.
Beim Sammeln von Männchen, kombinieren Sie zwei Fläschchen von 50 Fliegen in einer schmalen Durchstechflasche. Die Fläschchen für ZT13 und ZT19 in Folie wickeln. Nach dem Übertragen der Fliegen, klebe die Kappen an Ort und Stelle, um Verschüttungen zu vermeiden.
Legen Sie die Fläschchen vier Stunden lang auf den Nutating Mixer bei 165 RPM und vier Grad Celsius. Die Fliegen sind nicht mehr lichtempfindlich, so dass die Folie entfernt werden kann, um zu überprüfen, ob die Fliegen in der Fixierung untergetaucht sind. Nach dem Entfernen der Fläschchen aus dem Nutating Mixer, entfernen Sie das Formaldehyd, dann waschen Sie die Fliegen dreimal mit 3000 Mikroliter 1X PBS, invertiert die Durchstechflasche während jeder Wäsche.
Bewahren Sie die Fläschchen bei vier Grad Celsius auf, um die zukünftige Immunfluoreszenz abzuwarten. Licht und Dunkelheit wurden verwendet, um Fliegen zu zirkadianen Zyklen zu veranlassen. Die Entrainment wurde durch Immunoblotting und Immunfluoreszenzanalyse des Periodenproteins, einem Marker für zirkadiane Verzierung, überprüft.
Die Immunoblotting von ganzen Zellextrakten, die aus Köpfen von entrained Fliegen hergestellt werden, zeigt ein kanonisches Muster der Periode Proteinmobilität und Intensität. Die Immunfluoreszenz der eingezämmten Gehirne, die bei ZT1 gesammelt wurden, zeigt Periodenproteine in charakteristischen Mustern. Diese Methode ist ein Sprungpunkt für Immunfluoreszenz, Immunoplotting, Immunpräzipitation, Verhaltensanalyse und jede andere Technik, die Sie verwenden möchten, um zu vergleichen, wie sich der Weg ändert, wenn die biologische Uhr tickt.
Mit der Fähigkeit, Ihren Modellorganismus zu enschulen, können Sie fragen, ob sich Ihr Lieblingsweg im Laufe der Zeit ändert und ob die Auswirkungen in Ihrem Lieblingsweg zu einer Störung des biologischen Weges führen können. Eine Reihe von Krankheiten verschlimmern sich, wenn die biologische Uhr gestört wird. Die Identifizierung der zugrunde liegenden Mechanismen wird uns helfen, wirksamere Medikamente für Menschen zu entwickeln, die an Krankheiten wie Alzheimer und Parkinson leiden.
