Züchtung eines Mukoviszidose-relevanten polymikrobiellen Biofilms zur Untersuchung von Phänotypen in der Gemeinschaft

Wir versuchen zu verstehen, wie sich Mikroben verhalten, wenn sie unter Bedingungen gezüchtet werden, die reale Bedingungen nachahmen, mit dem Ziel, die Mechanismen zu bestimmen, die phänotypische Veränderungen in Mehrartengemeinschaften im Vergleich zum Wachstum von Monokulturen antreiben. Durch die Nutzung dieses in vitro Systems haben wir einen molekularen Signalweg charakterisiert, der die widerspenstigen Organismen von Pseudomonas aeruginosa, einem berüchtigten Erreger im Zusammenhang mit Mukoviszidose-Atemwegsinfektionen, antreibt. Aufgrund des 96-Well-Plattenformats und der Wachstumsbedingungen, die denen der Mukoviszidose-Lunge entsprechen, können wir ein breites Spektrum an Mikrobiom-Wechselwirkungen mit Leichtigkeit untersuchen.

Wir haben Einblicke in die Mechanismen gewonnen, die hinter der veränderten Anfälligkeit von Mikroben für antimikrobielle Wirkstoffe im Kontext des gesamten Mikrobioms stehen. Unser Modell dient als Brücke zwischen klinischen Beobachtungen und individueller Laborarbeit in der Mukoviszidoseforschung und bietet ein wertvolles Werkzeug, um verschiedene Mikrobiom-Wechselwirkungen zu untersuchen. Bereiten Sie zunächst alle erforderlichen Reagenzien und Medien vor.

Für das Co-Kultur-Experiment zentrifugieren Sie die bakteriellen Übernachtkulturen und waschen Sie die Zellen mit sterilem PBS. Entsorgen Sie nach dem Zentrifugieren den Überstand vorsichtig und resuspendieren Sie jedes Pellet in einem Milliliter 1X wasserverdünntem künstlichem Sputummedium oder ASM-Base. Messen Sie die optische Dichte von 1 bis 10 verdünnten Proben bei 600 Nanometern in einem Spektralphotometer oder in einem Plattenlesegerät.

Verdünnen Sie jede Bakterienprobe auf eine endgültige optische Dichte bei 600 Nanometern von 0,01 und wirbeln Sie sie fünf Sekunden lang gründlich durch. Geben Sie 100 Mikroliter der Monokultur- und Co-Kultur-Suspensionen in drei separate Vertiefungen einer sterilen 96-Well-Platte aus Kunststoff mit flachem Boden und inkubieren Sie die Platte 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius unter anoxischen Bedingungen. Entfernen Sie dann mit einer Mehrkanalpipette die nicht gebundenen Planktonzellen und füllen Sie die vorgeformten Biofilme mit 100 Mikrolitern frischem ASM oder dem gewünschten Behandlungsreagenz auf.

Nach dem Aspirieren der planktonischen Zellen waschen Sie die Biofilme vorsichtig zweimal vorsichtig mit 125 Mikrolitern sterilem PBS und entsorgen Sie die Waschlösung. Fügen Sie 50 Mikroliter steriles PBS hinzu. Und mit einem 96-poligen Replikator kratzte er die Zellen vorsichtig von der Platte ab.

Übertragen Sie die resuspendierten Biofilmzellen in Reihe A einer neuen sterilen 96-Well-Platte und führen Sie eine 10-fache serielle Verdünnung durch. Drei bis fünf Mikroliter jeder Verdünnungsprobe werden auf die Agarplatten aufgebracht. Nachdem die Impfflecken getrocknet sind, inkubieren Sie die Platten entsprechend.

Es wurden mehrere Phänotypen beobachtet, darunter eine Verringerung der Anzahl lebensfähiger Pseudomonas aeruginosa- und Staphylococcus aureus-Zellen bei der Zucht in einer gemischten Planktongemeinschaft im Vergleich zur Monokultur. Es wurde eine Zunahme des polymikrobiellen Wachstums von Streptococcus sanguinis und des Wachstums von Prevotella melaninogenica in Mischgemeinschaften beobachtet.