Die meisten Gesundheitszustände können besser behandelt werden, wenn sie frühzeitig erkannt werden. Biomarker, die in zugänglichen Körperflüssigkeiten verfügbar sind, sind die vielversprechendsten Methoden zur Früherkennung von Gesundheitszuständen. Wir berichten über Verbesserungen bei den Methoden zur Untersuchung von microRNA-Biomarkern, die über kleine extrazelluläre Vesikel aus dem menschlichen Gehirn freigesetzt werden.
Diese Methode hat es uns ermöglicht, Variationen in kleinen extrazellulären vesikalen Frachten zwischen verschiedenen genetischen Subtypen von Krankheiten, wie z. B. Demenz, zu identifizieren, Fracht-Biomarker-Kandidaten zu identifizieren, die in peripheren Flüssigkeiten nachgewiesen werden könnten, und die Früherkennung von Krankheiten zu verbessern. Dieses Protokoll gleicht Effizienz, Zugänglichkeit und Produktreinheit aus und ist daher in verschiedenen Laborumgebungen leicht reproduzierbar. Es ist keine spezielle Ausrüstung erforderlich und vorverpackte Säulen sorgen für Konsistenz.
Daher können alle Biomarker-Befunde leicht in ein gewünschtes klinisches Ergebnis übersetzt werden. Mit der Zulassung neuer krankheitsmodifizierender Medikamente muss die Diagnose dieser Krankheiten viel früher als derzeit möglich erfolgen, um den Nutzen für die Patienten zu maximieren. Methoden wie diese werden zur Identifizierung neuer krankheitsrelevanter microRNA-Biomarker führen, die zu einem besseren Gesundheitsmanagement durch spezifische Behandlungs- und Versorgungsoptionen führen können.
Wir werden unsere bestehenden Fähigkeiten nutzen, um Methoden zur Identifizierung gewebe- und zelltypspezifischer Marker zu entwickeln, die microRNA-Biomarker nachweisen können, die von einem bestimmten Zelltyp in einem heterogenen Gemisch in Körperflüssigkeiten freigesetzt werden. Schneiden Sie zunächst 250 Milligramm gefrorenes Hirngewebe mit einem sterilisierten Skalpell auf einer kalten Platte in dünne Scheiben. Geben Sie zwei Milliliter von 75 Einheiten pro Milliliter Kollagenase Typ III in Überwinterungslösung in das Gewebe.
Legen Sie jede Probe 20 Minuten lang in ein Wasserbad bei 37 Grad Celsius. Nach fünf Minuten drehen Sie die Probe zweimal um, um sie zu mischen. Pipettieren Sie die Probe nach 10 Minuten vorsichtig dreimal mit einem 10-Milliliter-Einwegstreifen aus Kunststoff.
Legen Sie dann jede Probe auf Eis und fügen Sie jeder Probe einen Proteasehemmer-Cocktail und einen Phosphatase-Hemmer hinzu. Zentrifugieren Sie jede Gehirngewebeprobe bei 300 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Sammelt den Überstand ein.
Und dann zentrifugieren Sie es bei 2000 G für 15 Minuten bei vier Grad Celsius. Sammeln Sie nun den Überstand und filtern Sie ihn durch einen 0,22-Mikrometer-Filter. Dann zentrifugieren Sie das Filtrat bei 10.000 g für 48 Minuten bei vier Grad Celsius.
Nach dem Sammeln des Überstands wird jeder Probe Fällungspuffer im Verhältnis von zwei zu eins zugesetzt. Und inkubieren Sie die Probe über Nacht bei vier Grad Celsius. Zentrifugieren Sie dann jede Probe bei 10.000 g für 96 Minuten bei vier Grad Celsius.
Und resuspendieren Sie das Pellet in 100 Mikrolitern extrazellulärem vesikelfreiem PBS. Die vorbereitete Größenausschlusschromatographie oder die SEC-Säule wird 15 Minuten lang bei Raumtemperatur äquilibriert. Entfernen Sie nach der Äquilibrierung den Konservierungsmittelpuffer von der Oberseite der Säule und waschen Sie die Säule zweimal mit 250 Mikrolitern extrazellulärem vesikelfreiem PBS.
Geben Sie dann das resuspendierte Pellet in die Säule und zentrifugieren Sie es 30 Sekunden lang bei 50 g. Nachdem Sie den Durchfluss verworfen haben, fügen Sie 180 Mikroliter EV-freies PBS hinzu und zentrifugieren Sie die Säule eine Minute lang bei 50 G, damit die aus dem Gehirn stammenden kleinen extrazellulären Vesikel eluieren können. Um kleine extrazelluläre Vesikel zu läusieren, verdünnen Sie die isolierte kleine extrazelluläre Vesikelprobe im gleichen Verhältnis mit Lyse- und Extraktionspuffer.
Rühren Sie die verdünnte Probe 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius. Zentrifugieren Sie die Probe dann 15 Minuten lang bei 14.000 g. Sammeln Sie den Proteinüberstand und messen Sie die Proteinkonzentrationen mit einem Protein-Assay-Kit.
Um eine Nanopartikel-Tracking-Analyse durchzuführen, verdünnen Sie jede Probe in PBS mit einem Verdünnungsfaktor von 1 bis 1000. Injizieren Sie die Probe in das NTA-Instrument. Und stellen Sie das Gerät so ein, dass es die Probe bei einer Wellenlänge von 550 Nanometern ablestet.
Verwenden Sie die Partikelmenge, um die Proteinmenge pro Partikel zu messen, ausgedrückt in Femtogramm gemäß den MISEV-Richtlinien. Als nächstes verdünnen Sie die Zellmaske Orange oder den CMO-Farbstoff in PBS mit einem Verdünnungsfaktor von 1 bis 1000. Verdünnen Sie dann den CMO-Farbstoff mit der kleinen extrazellulären Vesikelprobe unter Verwendung eines Verdünnungsfaktors von 1 bis 10.
Und die Mischung im Dunkeln 30 Minuten bei vier Grad Celsius inkubieren. Verdünnen Sie nun das CMO-Farbstoff-Gemisch aus kleinen extrazellulären Vesikeln weiter mit PBS bei einem Verdünnungsfaktor von 1 bis 1000. Mit dem NTA-Instrument wird der CMO-Farbstoff jeder kleinen extrazellulären Vesikelprobe bei einer Wellenlänge von 550 Nanometern abgelesen.
Für die Nachverfolgung von Fluoreszenzantikörpern verdünnen Sie jeden Tetraspan- und Fluoreszenzantikörper in PBS mit einem Verdünnungsfaktor von 1 bis 10. Verdünnen Sie dann jeden Antikörperfarbstoff mit der kleinen extrazellulären Vesikelprobe unter Verwendung eines Verdünnungsfaktors von 1 bis 10. Und die Mischung zwei Stunden lang im Dunkeln bei vier Grad Celsius inkubieren.
Als nächstes verdünnen Sie die zweite Antikörpermischung mit PBS mit einem Verdünnungsfaktor von 1 bis 1000. Lesen Sie die fluoreszierenden Antikörpersignale der kleinen extrazellulären Vesikelprobe bei einer Wellenlänge von 550 Nanometern mit dem NTA-Gerät ab. Die Western-Blot-Analyse bestätigte das Vorhandensein der positiven Marker CD9, CD63, CD81, Flotilla One und TSG101 in kleinen extrazellulären Vesikeln aus dem Gehirn, während Calnexin nicht vorhanden war, was auf keine zelluläre Kontamination hinweist.
Die Analyse der Nanopartikelverfolgung ergab, dass die isolierten Partikel zwischen 50 und 200 Nanometer groß waren, mit einer Spitzenkonzentration von etwa 100 Nanometern. Die CMO-Färbedaten zeigten, dass 52,35 % der Partikel eine Lipiddoppelschicht aufweisen, von denen 34,66 % CD9, 15,49 % CD63 und 12,01 % CD81 enthielten.
