The authors thank David Larson for developing the original protocol for imaging the live Drosophila pupal eye. We thank our colleagues Richard Carthew, Shoichiro Tsukita and Matthew Freeman, who developed the transgenic flies that we combined to generate our live-imaging fly lines. Brittany Baldwin-Hunter gave helpful comments on the manuscript. This work was supported by start-up funds awarded to Ruth Johnson by Wesleyan University.

3 zeigt eine Zusammenfassung der experimentellen Verfahren. 1. Gewebepräparation <ol><li> Um die Folgen der veränderten Expression eines Gens von Interesse, die folgende Quer in zweifacher Ausfertigung zur Ermittlung und Pflege bei 25 ° C: UAS-Transgen (Männer) X GMR-GAL4; UAS-α-Katze: GFP, ubi-DE-Cad: GFP; + / SM5-TM6b (jungfräulichen Weibchen) HINWEIS: Um Kontrollgewebe Quer UAS-lacZ erhalten Männchen zu GMR-GAL4; UAS-α-Katze: GFP, ubi-DE-Cad: GFP Frauen. β-Galactosidase erzeugt keine Mängel in den Zellverhalten in der Netzhaut. </li><li> Um die Wirksamkeit der RNAi Transgenen zu verbessern, Männchen Quer UAS-RNAi, um GMR-GAL4, UAS-DCR-2; UAS-α-Katze: GFP, ubi-DE-Cad: GFP; + / SM5-TM6b jungfräulichen Weibchen. HINWEIS: Gelegentliche Fehler in das Zellverhalten in retinae Ausdruck Eileiter DCR-2 beobachtet (Daten nicht gezeigt). Wachsamkeit ist empfehlenswert, wenn mit diesem Ansatz. </li><li> Select weiß Pre-Puppen von geeigneten Genotypen und in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Wenn die Puppen zum Ausdruck DCR-2, wählen Sie entweder männlich oder weiblich Puppen: Ausdruck der UAS-DCR-2 ist ein Einsatz auf dem X-Chromosom, ist stärker bei Männern. Puppen sollten bei 0 h APF vor Pigmentierung der Puppenhülle sexed werden - die Keimdrüsen der Männchen sind so groß scheinenden Kugeln auf den Seiten der Puppe (etwa ein Drittel aus dem hinteren) sichtbar. </li><li> Mikrozentrifugenröhrchen, die Puppen in einem sauberen Plastikspitze-Box bei 25 ° C inkubieren. Um Austrocknung der Puppen Ort verhindern, dass ein 10 cm 2 Gewebestück, in destilliertem Wasser eingeweicht, in die Spitze-Box. HINWEIS: Wenn die Luftfeuchtigkeit im Tip-Box zu hoch wird die Puppenhülle kann matschig und schwer in den nachfolgenden Schritten zu sezieren werden. </li><li> Inkubieren für angemessene Zeit. Zur Erfassung Zelle Verhalten mit Mustern des Auges verbunden sind, vorzubereiten Puppen für die Bildgebung bei rund 17 Stunden APF, 20 Stunden oder 24-Stunden-APF APF. Siehe Repräsentative Ergebnisse für die weitere Diskussion auf, wenn bestimmte Zelle Verhaltensweisen am besten beobachtet. </li><li> Legen Sie ein Stück frischen doppelseitigem Klebeband auf einem schwarzen Sylgard Dissektion Gericht. Positionieren Sie eine Puppe, Rückenseite nach oben, mit dem Kopf der Puppe mit dem doppelseitigen Klebeband (1A) eingehalten .try nicht, den Brust- und Bauch Regionen der Puppe mit dem doppelseitigen Klebeband haften. Mit einer Pinzette vorsichtig anheben und entfernen Sie das Operculum, den Puppenkopf aus. Reißen entlang der Seite der Puppenhülle um den Bereich um ein Auge aus. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die Puppe vom Klebeband. Wenn die Puppe haften bleibt, geben Sie eine kleine Menge von destilliertem Wasser zu dem Übergang zwischen der Puppenhülle und Klebeband, um die Haftung zu schwächen. </li></ol> 2. Montage <ol><li> Konstruktion eines kleinen 15 mm 2 Rahmen aus Löschpapier und ein Loch in der middlethat ist 5,5 mm im Durchmesser (1B). Tauchen Sie ein in destilliertem Wasser und indie Mitte eine Mikroskop-Objektträger. Mit einem 30-ml-Spritze, Squeeze-out eine einheitliche Ring Vaseline das Löschpapier Frame zu umgeben. Sicherzustellen, daß die Vaseline Ring geringfügig höher ist als die Breite der Puppe und daß der Durchmesser des Rings geringfügig kleiner als die Breite eines Deckglases ist. </li><li> Fügen Sie eine kleine Raupe aus Vaseline direkt auf den Objektträger, in das Loch in das Löschpapier (1C) gestanzt .Carefully ordnen Sie die Puppe auf die Seite, von der Vaseline Wulst (1D) unterstützt. </li><li> Legen Sie ein Deckglas auf der Oberseite des Vaseline Ring, so dass er in Kontakt mit dem Epithel über dem Auge Neuroepithel (1D). Komprimieren Sie vorsichtig die Vorbereitung auf das Deckglas gegen die Vaseline verschließen und erzeugen einen kleinen flachen Kontaktfläche zwischen dem Puppenaugenbereich und dem Deckglas. </li></ol> 3. Fluoreszenz-Imaging <ol><li> Bild des Puppenvorbereitung mit einFluoreszenzmikroskop. Alle 7 min Abscheidung Serienschnitte durch den apikalen Domäne des Auges Neuroepithel, in den Bereich der Adhärenzverbindungen. HINWEIS: a) geeignete Serienschnitte sind in der Regel 4-5 pro Z-Stapel von 0,2 um z-Schritten zusammen. b) Unregelmäßigkeiten in der Topologie des Epithels, einschließlich milde Beulen und Falten, kann es schwierig sein Scharf Bilder von großen Gewebebereiche zu erwerben. Während Bildgebung kann ein Teil eines Bereichs von Interesse zu finden, um in-Fokus, und eine Nachbarregion zu out-of-Fokus. Einschließlich ein kleines Tröpfchen destilliertes Wasser zwischen dem Puppen Auge und Deck einige akute Gewebefalten aber nicht beseitigen die leicht unebenen Topologie Eigenschaft der frühen Stadien der Puppenauge Morphogenese. In diesen Fällen überabzutasten das Gewebe durch die Verlängerung der Z-Stapel, bis Scharf Scheiben werden für den gesamten Bereich erworben. c) Aufnahme von Serienschnitten alle 7 min sollten Live-Bildgebung für 3 bis 4 Stunden ohne signifikante redu aktivierenction in der Intensität der GFP-Fluoreszenz, die die Bildqualität beeinträchtigen können. Kürzere Zeitintervalle können die Gesamtzeit der Bildgebung zu reduzieren. </li><li> Weiter Bildgebung für 3 bis 4 Stunden. Verwenden Sie keinen Autofokus und Zeitfunktion, die auf vielen Fluoreszenz-Mikroskope zur Verfügung steht, da Puppen Wachstum und Pumpen der Hämolymphe bewegt sich die Position der Netzhaut und wachsam Neuausrichtung benötigt jede 14 bis 21 min. Beachten Sie, dass Bildgebung über 4 Stunden kann verlangsamen oder zum Stillstand Morphogenese des Auges. </li><li> Verwenden Sie geeignete Entfaltungssoftware Hintergrund zu verringern und den Kontrast der seriellen Schnittbilder. Für jede Z-Stapel-Datei, führen Sie das folgende in LAS AF Software (siehe Tabelle der Werkstoffe): Wechseln Sie zum Werkzeugfenster, wählen Sie 3D Dekonvolution und klicken Sie auf Übernehmen. </li><li> Erzeugen Sie eine maximale Projektion (MP) für jeden entfaltet Stack-Datei: Navigieren Sie zu der Werkzeugleiste, wählen Sie 3D-Projektion und klicken Sie auf Übernehmen. Hinweis: Die maximale Projektionsalgorithmus kann fehlschlagen, ein einheitliches erzeugenly Bild in-Fokus für Gewebe, die überabgetastete hat. Ein Verfahren zum Schärfen von out-of-focus-Regionen in Schritt 5.2 beschrieben sind. </li></ol> 4. Post-Bildgebung Pupal Rettungs- und Phänotyp Verification <ol><li> Um Adresse, ob Artefakte eingeführt wurden oder die Puppe während der Bildgebung zu Schaden, entfernen Sie vorsichtig die Puppe von der Bild rig: mit einer Pinzette entfernen Sie die Deckglas und übertragen Sie die Puppe in eine saubere Phiole von Lebensmitteln. Bei einer Raumtemperatur oder 25 ° C, bis die erwachsene Fliege auftaucht. </li><li> Sorgfältig prüfen, den Phänotyp der erwachsenen Auge und im Vergleich zu den Augen der erwachsenen Fliegen, die aus dem ursprünglichen Flug Kreuz. </li></ol> 5. Bildverarbeitung <ol><li> Automatische Bildausrichtung: HINWEIS: Die Live Drosophila Gewebe verschieben und zu wachsen in der gesamten Abbildungsprozesses. Folglich sind die Mitten der Bilder gesammelt zu aufeinanderfolgenden Zeitpunkte nicht auf den gleichen Punkt in der Drosophila Gewebe entsprechen. Neben dergesamte Retina Scheibe dreht sich um 30 ° zwischen ~ 21 und 23 h APF. Um einzelne Zelle Verhaltensweisen hervorheben und Ablenkungen durch organismal Wachstum zu reduzieren, richten Sie jeden MP image.While dies kann manuell durchgeführt werden, die Bildbearbeitungs-Software verwendet hier (siehe Tabelle der Materialien) verfügt über eine integrierte Algorithmen, die den Prozess zu beschleunigen kann. <ol><li> Von der Registerkarte Datei im Hauptmenü geöffnet Scripts und wählen Sie Dateien in Stapel laden. </li><li> Importieren Sie die MP-Bilddateien in das Panel laden Layer und wählen Sie OK. Stellen Sie sicher, dass der Versuch, die Bilder-Option Quelle automatisch ausrichten nicht aktiviert ist. HINWEIS: Wenn diese Option aktiviert ist, kann die Software eine Alignment-Algorithmus, der die Bilddaten verfälscht verwenden. </li><li> Sobald alle MP-Dateien in die Ebenen-Fensterbereich geladen werden, um sicherzustellen, dass alle Bilder in chronologischer Reihenfolge, so dass der früheste Zeitpunkt ist an der Spitze des Schichtstapels. Wenn die Schichten nicht in der richtigen Reihenfolge per Drag &amp; Drop, bis sie bestellt werdenrichtig. </li><li> Wählen Ebenen automatisch ausrichten auf der Registerkarte Bearbeiten des Hauptmenüs. Wählen Sie neu positionieren und klicken Sie auf OK. </li><li> Wenn die Auto-Align-Algorithmus nicht den Rahmen zu einem relevanten Schwerpunkt zu orientieren, stellen kleinere Anpassungen mit dem Verschieben-Werkzeug. </li></ol></li><li> Verbundschleif: HINWEIS: Out-of-Schwerpunktregionen eines anfänglichen Bild MP kann durch &quot;Abschneiden&quot; der entsprechende entfaltet Stack in LAS AF Software geschärft werden. Zuschneiden eines Stack-Datei ermöglicht es, den Abstand eines Z-Stapel, der dem Maximum Projektion-Algorithmus unterzogen wird manuell zu beschränken. <ol><li> Suchen Sie die Crop-Funktion in der Werkzeugleiste (unter der Registerkarte Prozess). Manuell begrenzen die ersten und letzten Schichten, so dass sie nur das Haftband im anfänglich außerhalb des Fokusbereichs zu überspannen. Klicken Sie auf Übernehmen, um einen neuen Stapel-Datei, die für diese Region optimiert ist zu generieren. </li><li> Generieren Sie ein neues Maximum Projektion für die lokal optimierte Stack und Export als TIFF-Datei. </li><li> In the Bildbearbeitungs-Software (siehe Tabelle der Materialien), offene Scripts (in der Registerkarte Datei des Hauptmenüs befindet) und wählen Sie Dateien in Stapel laden. </li><li> Importieren Sie die anfängliche Bild MP-Datei und vor Ort optimiert MP-Datei für einen bestimmten Zeitpunkt in das Panel laden Layer und wählen Sie OK. Stellen Sie sicher, dass der Versuch, die Bilder-Option Quelle automatisch ausrichten nicht aktiviert ist. </li><li> Wählen Sie beide Schichten in der Ebenen-Fensterbereich und wählen Sie Ebenen automatisch überblenden (in der Registerkarte Bearbeiten des Hauptmenüs befindet), um die entsprechenden Bereiche der beiden Bilder automatisch zu maskieren, wodurch eine gleichmäßig im Fokus der Netzhaut ein. Sichern Sie das Bild Verbund als TIFF-Datei. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 5.2.1 bis 5.2.5 für alle suboptimalen MP Bilder. </li></ol></li><li> Weitere Einstellmöglichkeiten: drehen, zuschneiden und stellen Sie die Pegel der Film-Schichten: <ol><li> Mit all den Schichten gewählt, verwenden Sie das Transformieren-Werkzeug (Edit&gt; Free Transform), um die Bilder zu drehen, so dass der dorsal-ventralen Achse der Netzhaut ist ausgerichtetzu der y-Achse des Films Rahmen. </li><li> Verwenden Sie gegebenenfalls die Freistellungswerkzeug, um das Sichtfeld auf die gewünschte Größe und Form zu reduzieren. </li><li> Verwenden Pegeleinstellung (von Einzelbildern), die zur Verbesserung Kontrast zwischen der Zellmembran und Zellkörper. </li><li> Für stilistischen Zwecken und an spezifische Zellverhalten zu betonen, stellen Falschfarben zu Sehenswürdigkeiten in jedem Bild zu markieren. </li></ol></li><li> Animation: Konvertieren Sie die Bilder in einen Film: <ol><li> Öffnen Sie das Animationsfenster aus dem Windows-Register des Hauptmenüs. Wählen Stellen Frames von Schichten aus dem Menü in der oberen rechten Ecke des Animationsbereich entfernt. </li><li> Man beachte, dass die Schichten der Animationsfenster in sequentieller Reihenfolge, beginnend von der Unterseite des Stapels hinzugefügt. Um die Reihenfolge der Frames umgekehrt, zunächst alle Bilder auswählen und dann umge Frames aus dem Animationsfenster Menü. </li><li> Wählen Sie eine Bildverzögerungszeit für jedes Bild mit Hilfe der Dropdown-Menü unten am Rahmen DaumenNagel. HINWEIS: Die Frame-Verzögerung für Filme 1 bis 4 in diesem Papier ist 0,8 Sekunden. </li><li> Von der Registerkarte Datei im Hauptmenü geöffnet Export und wählen Sie Video Render. Wählen Sie Quicktime-Export unter Dateioptionen und wählen Sie das gewünschte Videoformat. Unter Render Optionen eingestellt Frame Rate auf Benutzerdefiniert, geben Sie eine Bildrate von 15, und klicken Sie auf Render. </li></ol></li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Die Beschreibung der Wildtyp-Entwicklung (siehe oben) ist die Basis für Vergleiche der Strukturierung Ereignisse in RNAi oder Überexpression Genotypen. Vergleiche von lebenden Gewebeentwicklung sind von unschätzbarem Wert, wenn genau zu bestimmen, welcher Zellverhalten werden durch ein Protein von Interesse reguliert. Weitere und hier nicht beschrieben, ermöglicht Live Cell Imaging eine qualitative und / oder quantitative Beschreibungen der Rolle eines Gens von Interesse in den Ereignissen, die Muster das Auge zu ma...

Die Verbindung Drosophila Auge wird durch die stereotype Anordnung seiner ~ 750 Ommatidien von einem Wabengitter von Zubehörpigmentzellen 4,5 getrennt sind. Lokale Zellbewegungen, Zellwachstum, die Veränderungen in der Zellform und Apoptose: Diese Pigmentzellen werden durch eine koordinierte Kombination von Ereignissen gemustert. Live-Anzeige dieser Epithel ermöglicht es, die molekularen Mechanismen, auf denen diese Ereignisse in einem physiologisch relevanten und gelassen dreidimensionalen Kontext zu untersuchen. Im Gegensatz zu bisherigen Protokolle 6,7, die Technik hier skizzierten umfasst ein effizientes Verfahren zum Stabilisieren von äußerem Gewebe Bewegung, die nicht entkoppelt von dem Abbildungsprozess sein kann. Dieses Verfahren verbessert die Untersuchungen des Zellverhaltens in dem Entwicklungs Drosophila Puppenauge Epithel - einem Gewebe wächst dreht und verschiebt sich im Laufe der Bildverarbeitung. Neben der Bewegungsstabilisierungstechnik dehier beschrieben wird zur Untersuchung von Zellen in anderen Zusammenhängen, wo Fremdbewegung auftritt. Um Zellgrenzen in der Netzhautfeld Drosophila sichtbar zu machen, wurden transgene Fliegenlinien erzeugt, die ubi-DE-Cadherin Ausdruck: GFP sowie UAS-α-Catenin: GFP unter Kontrolle des Auges spezifischen Treiber GMR-GAL4 1-3. Die Verwendung von zwei GFP-markierten Membranmarker erlaubt die Visualisierung von Zellgrenzen zu niedrigeren Lichtintensität. Dies minimiert Gewebeschäden und Photobleaching auf wiederholte Exposition gegenüber Hochenergiewellenlängen, so dass erhöhte Bildrate und Filmdauer. Zur Verbesserung der Wirksamkeit der RNAi-Transgene, UAS-DCR-2 wurde auch in eine zweite Fliege Linie 8 eingearbeitet. In einem dritten Update von früheren Protokollen wird ein einfacher Bild rig, die leicht in den meisten Labors zusammengesetzt beschrieben. Diese Vorrichtung vermeidet die Erfordernis, eine spezielle Abbildungs ​​r habenig von einer Universität &quot;Werkstatt&quot; oder ähnlichen Dienst generiert. Diese Bild rig ist ähnlich wie die Bild anderen Puppen Gewebe 9,10 verwendet. Präsentiert hier ist eine einfache Live-Cell-Imaging-Protokoll, das verwendet werden kann, um direkt bewerten die morphogenetischen Ereignisse, die zu Augen Strukturierung von ~ 17 bis 42 Stunden nach der Pupariumbildung (hr APF) beitragen. Insbesondere ermöglicht es dieses Protokoll, um die Konsequenzen der Modifizierung Genexpression während Puppenentwicklung zu bestimmen.

<table><tbody><tr><td>GMR-GAL4; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP ; + / SM5-TM6b</td><td>Available on request from authors</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UAS-dcr-2; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP; + / SM5-TM6b&amp;nbsp;</td><td>Available on request from authors</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scotch double stick tape</td><td>3M</td><td>665</td><td></td></tr><tr><td>Black Sylgard dissection dish</td><td></td><td></td><td>Fill glass petri dish to rim with Sylgard (colored black with finely-ground charcoal powder) or Sylgard 170; leave at room temperature for 24-48 hr to polymerize</td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>Dow Corning</td><td>SYLG184</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard (Black)</td><td>Dow Corning</td><td>SYLG170</td><td></td></tr><tr><td>Glass petri dish</td><td>Corning</td><td>7220-85</td><td></td></tr><tr><td>25 x 75 x 1 mm glass microscope slide</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-413</td><td></td></tr><tr><td>22 x 40 mm glass coverslip</td><td>VWR</td><td>48393-172</td><td></td></tr><tr><td>Forceps&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 3mm Chromatography Paper</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-713-336</td><td></td></tr><tr><td>Vaseline</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-086-291</td><td>Or purchase at local pharmacy.</td></tr><tr><td>30 ml syringe</td><td>Fisher Scientific</td><td>S7510-30</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP5 DM microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LAS AF Version 2.6.0.7266 microscope software</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

live-imaging of the drosophila pupal eye

Inhärenten Prozesse der Drosophila Puppenentwicklung können sich verschieben und verdrehen die Augen Epithel in einer Weise, die einzelnen Zellverhalten schwer in lebenden Zellen zu verfolgen, zu machen. Diese Prozesse umfassen: Netzhautrotation, das Zellwachstum und organismischen Bewegung. Zusätzlich Falten Unregelmäßigkeiten in der Topologie des Epithels, einschließlich feinen Unebenheiten und oft eingeführt, wie die Puppe zur Abbildung hergestellt, es schwer machen, in unscharfe Bilder von mehr als ein paar Ommatidien in einer einzigen Brennebene zu erwerben. Der Workflow skizzierten Heil diese Fragen, was eine einfache Analyse zellulärer Prozesse bei Drosophila Puppenaugenentwicklung. Passenderstufigen Puppen sind in einem bildgebenden rig, die leicht in den meisten Labors montiert werden kann angeordnet Ubiquitin-DE-Cadherin. GFP und GMR-GAL4 -driven UAS-α-Catenin: GFP werden verwendet, um Zellgrenzen im Auge Epithel 1 visualisieren -3. Nach Dekonvolution istFluoreszenzbildern mit mehreren Fokusebenen erfasst angewendet werden maximale Projektionsbilder für jeden Zeitpunkt erzeugt und verstärkt mit einer Bildbearbeitungssoftware. Alignment-Algorithmen verwendet werden, um schnell zu stabilisieren flüssige Bewegung, so dass einzelne Zelle Verhalten leichter zu verfolgen.

Live-Bildgebung des Puppen Auge ist eine erfolgreiche Strategie zur Zelle Verhaltensweisen, die Strukturierung der Neuroepithel beitragen beobachten. Die Rolle von spezifischen Proteinen kann leicht durch Expression von Transgenen, die während der Entwicklung des Auges Protein-Ebene ändern zu bewerten. Um dieses GMR-GAL4 tun wird zur Expression des Transgens hinter dem morphogenetischen Furche fahren. Dies bietet den Vorteil, nicht zu stören früheren Veranstaltungen, die das Auge Bereich in den ersten beide...

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Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Live-Bilder aus dem<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupal Augen

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

9.4K Aufrufe.  Wesleyan University. This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Serie: Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Live-Cell-Imaging von Sinnesorgan Vorläuferzellen im Intact Drosophila Puppen

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Forschung

Neurowissenschaften

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

Langfristige Live-Imaging von<em&gt; Drosophila</em&gt; Augen Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Entwicklungsbiologie

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons. While recent progress has been made to describe the live migration of glial cells in the developing pupal wing (1), studies of Drosophila glial cell migration have typically involved the examination of fixed tissue. Live microscopic analysis of motile cells offers the ability to examine cellular behavior throughout the migratory process, including determining the rate of and changes in direction of growth. Paired with use of genetic tools, live imaging can be used to determine more precise roles for specific genes in the process of development. Previous work by Silies et al. (2) has described the migration of glia originating from the optic stalk, a structure that connects the developing eye and brain, into the eye imaginal disc in fixed tissue. Here we outline a protocol for examining the live migration of glial cells into the Drosophila eye imaginal disc. We take advantage of a Drosophila line that expresses GFP in developing glia to follow glial cell progression in wild type and in mutant animals.

Here we describe a protocol to examine the migration of glial cells into the developing Drosophila eye using live microscopic analysis paired with GFP tagged glial cells.

Live-Imaging von Gliazellen Migration in der Drosophila Eye Imaginalscheibe

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

Biologie

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from animals to humans. Therefore, the powerful Drosophila model system can be used to study concepts of muscle-tendon development that can also be applied to human muscle biology. Here, we describe in detail how morphogenesis of the adult muscle-tendon system can be easily imaged in living, developing Drosophila pupae. Hence, the method allows investigating proteins, cells and tissues in their physiological environment. In addition to a step-by-step protocol with helpful tips, we provide a comprehensive overview of fluorescently tagged marker proteins that are suitable for studying the muscle-tendon system. To highlight the versatile applications of the protocol, we show example movies ranging from visualization of long-term morphogenetic events &#8211; occurring on the time scale of hours and days &#8211; to visualization of short-term dynamic processes like muscle twitching occurring on time scale of seconds. Taken together, this protocol should enable the reader to design and perform live-imaging experiments for investigating muscle-tendon morphogenesis in the intact organism.

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Here, we present an easy-to-use and versatile method to perform live imaging of developmental processes in general and muscle-tendon morphogenesis in particular in living Drosophila pupae.

In Vivo Bildgebung der Muskel-Sehnen-Morphogenese in Drosophila Puppen

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

Mesoscopic Fluoreszenz-Tomographie für In-vivo Imaging der Entwicklungsländer Drosophila</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given their relevance to development and disease, understanding the mechanisms that govern asymmetric stem cell division has been a robust area of study. Because they are genetically tractable and undergo successive rounds of cell division about once every hour, the stem cells of the Drosophila central nervous system, or neuroblasts, are indispensable models for the study of stem cell division. About 100 neural stem cells are located near the surface of each of the two larval brain lobes, making this model system particularly useful for live imaging microscopy studies. In this work, we review several approaches widely used to visualize stem cell divisions, and we address the relative advantages and disadvantages of those techniques that employ dissociated versus intact brain tissues. We also detail our simplified protocol used to explant whole brains from third instar larvae for live cell imaging and fixed analysis applications.

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

This protocol details a streamlined method used to conduct live cell imaging in the context of an intact larval brain. Live cell imaging approaches are invaluable for the study of asymmetric neural stem cell divisions as well as other neurogenic and developmental processes, consistently uncovering mechanisms that were previously overlooked.

Live-Imaging von<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven Neuroblasten

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

Erstellung von Entwicklungs-und Adult Drosophila Brains und retinae für Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

<meta charset="utf8"></head><body>Erweiterte Live-Bildgebung der Morphogenese der Puppenbein von Drosophila ohne Puparium

Long-Term Live Imaging of Drosophila Pupal Leg Development After Puparium Removal

Over the past decades, significant progress has been made in understanding the mechanisms of cell fate determination. However, the process by which fate-determined cells form three-dimensional organismal shapes remains unclear. Recent advances in confocal microscopy have facilitated efforts to observe cell dynamics during development through live imaging. The Drosophila melanogaster pupa is ideal for live imaging due to its immobility, transparent pupal cuticle, and the availability of fluorescent reporter lines. A primary challenge for imaging is the puparium, the cuticle surrounding the pupa, which obstructs optical imaging. While previous methods involved either partial or complete removal of the puparium, maintaining pupal viability for extended periods after this procedure has remained challenging. Here, a simple method is presented for days-long live imaging of the Drosophila leg during the pupal stage, involving complete puparium removal. The method includes removing the puparium from a pupa adhered to double-sided tape, followed by assembling a small chamber on a glass-bottom dish to enclose the pupa and a drop of water. This setup is straightforward, reliable, and supports extended pupal survival by preventing desiccation. Long-term live imaging of the Drosophila pupa has significantly contributed to capturing how the adult leg undergoes dramatic three-dimensional structural changes over 2-3 days. These changes include the transient formation of an intriguing structure (the Parthenon-like structure) by epithelial cells, rapid tissue narrowing, joint formation, and bristle elongation. This method is applicable to the observation of various tissues and can potentially be combined with other techniques, such as optical gene induction, to advance the understanding of cell dynamics during the final shape formation of tissues in the pupal stage.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Aufdeckung dynamischer Epithelstrukturen während der Entwicklung von Drosophila

Here, a protocol is presented for long-term live imaging of the Drosophila leg during the pupal stage, involving complete removal of the puparium. This protocol can also be applied to other tissues.

Langzeit-Live-Bildgebung der Entwicklung der Puppenbein von Drosophila nach Entfernung der Puppen

Over the past decades, significant progress has been made in understanding the mechanisms of cell fate determination. However, the process by which ...

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Live-Imaging von

Erstellung von Entwicklungs-und Adult Drosophila Brains und retinae für Live Imaging

Langzeit-Live-Bildgebung der Entwicklung der Puppenbein von Drosophila nach Entfernung der Puppen

Langzeit-Live-Bildgebung der Entwicklung der Puppenbein von Drosophila nach Entfernung der Puppen

Langzeit-Live-Bildgebung der Entwicklung der Puppenbein von Drosophila nach Entfernung der Puppen