The authors thank David Larson for developing the original protocol for imaging the live Drosophila pupal eye. We thank our colleagues Richard Carthew, Shoichiro Tsukita and Matthew Freeman, who developed the transgenic flies that we combined to generate our live-imaging fly lines. Brittany Baldwin-Hunter gave helpful comments on the manuscript. This work was supported by start-up funds awarded to Ruth Johnson by Wesleyan University.

3 zeigt eine Zusammenfassung der experimentellen Verfahren. 1. Gewebepräparation <ol><li> Um die Folgen der veränderten Expression eines Gens von Interesse, die folgende Quer in zweifacher Ausfertigung zur Ermittlung und Pflege bei 25 ° C: UAS-Transgen (Männer) X GMR-GAL4; UAS-α-Katze: GFP, ubi-DE-Cad: GFP; + / SM5-TM6b (jungfräulichen Weibchen) HINWEIS: Um Kontrollgewebe Quer UAS-lacZ erhalten Männchen zu GMR-GAL4; UAS-α-Katze: GFP, ubi-DE-Cad: GFP Frauen. β-Galactosidase erzeugt keine Mängel in den Zellverhalten in der Netzhaut. </li><li> Um die Wirksamkeit der RNAi Transgenen zu verbessern, Männchen Quer UAS-RNAi, um GMR-GAL4, UAS-DCR-2; UAS-α-Katze: GFP, ubi-DE-Cad: GFP; + / SM5-TM6b jungfräulichen Weibchen. HINWEIS: Gelegentliche Fehler in das Zellverhalten in retinae Ausdruck Eileiter DCR-2 beobachtet (Daten nicht gezeigt). Wachsamkeit ist empfehlenswert, wenn mit diesem Ansatz. </li><li> Select weiß Pre-Puppen von geeigneten Genotypen und in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Wenn die Puppen zum Ausdruck DCR-2, wählen Sie entweder männlich oder weiblich Puppen: Ausdruck der UAS-DCR-2 ist ein Einsatz auf dem X-Chromosom, ist stärker bei Männern. Puppen sollten bei 0 h APF vor Pigmentierung der Puppenhülle sexed werden - die Keimdrüsen der Männchen sind so groß scheinenden Kugeln auf den Seiten der Puppe (etwa ein Drittel aus dem hinteren) sichtbar. </li><li> Mikrozentrifugenröhrchen, die Puppen in einem sauberen Plastikspitze-Box bei 25 ° C inkubieren. Um Austrocknung der Puppen Ort verhindern, dass ein 10 cm 2 Gewebestück, in destilliertem Wasser eingeweicht, in die Spitze-Box. HINWEIS: Wenn die Luftfeuchtigkeit im Tip-Box zu hoch wird die Puppenhülle kann matschig und schwer in den nachfolgenden Schritten zu sezieren werden. </li><li> Inkubieren für angemessene Zeit. Zur Erfassung Zelle Verhalten mit Mustern des Auges verbunden sind, vorzubereiten Puppen für die Bildgebung bei rund 17 Stunden APF, 20 Stunden oder 24-Stunden-APF APF. Siehe Repräsentative Ergebnisse für die weitere Diskussion auf, wenn bestimmte Zelle Verhaltensweisen am besten beobachtet. </li><li> Legen Sie ein Stück frischen doppelseitigem Klebeband auf einem schwarzen Sylgard Dissektion Gericht. Positionieren Sie eine Puppe, Rückenseite nach oben, mit dem Kopf der Puppe mit dem doppelseitigen Klebeband (1A) eingehalten .try nicht, den Brust- und Bauch Regionen der Puppe mit dem doppelseitigen Klebeband haften. Mit einer Pinzette vorsichtig anheben und entfernen Sie das Operculum, den Puppenkopf aus. Reißen entlang der Seite der Puppenhülle um den Bereich um ein Auge aus. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die Puppe vom Klebeband. Wenn die Puppe haften bleibt, geben Sie eine kleine Menge von destilliertem Wasser zu dem Übergang zwischen der Puppenhülle und Klebeband, um die Haftung zu schwächen. </li></ol> 2. Montage <ol><li> Konstruktion eines kleinen 15 mm 2 Rahmen aus Löschpapier und ein Loch in der middlethat ist 5,5 mm im Durchmesser (1B). Tauchen Sie ein in destilliertem Wasser und indie Mitte eine Mikroskop-Objektträger. Mit einem 30-ml-Spritze, Squeeze-out eine einheitliche Ring Vaseline das Löschpapier Frame zu umgeben. Sicherzustellen, daß die Vaseline Ring geringfügig höher ist als die Breite der Puppe und daß der Durchmesser des Rings geringfügig kleiner als die Breite eines Deckglases ist. </li><li> Fügen Sie eine kleine Raupe aus Vaseline direkt auf den Objektträger, in das Loch in das Löschpapier (1C) gestanzt .Carefully ordnen Sie die Puppe auf die Seite, von der Vaseline Wulst (1D) unterstützt. </li><li> Legen Sie ein Deckglas auf der Oberseite des Vaseline Ring, so dass er in Kontakt mit dem Epithel über dem Auge Neuroepithel (1D). Komprimieren Sie vorsichtig die Vorbereitung auf das Deckglas gegen die Vaseline verschließen und erzeugen einen kleinen flachen Kontaktfläche zwischen dem Puppenaugenbereich und dem Deckglas. </li></ol> 3. Fluoreszenz-Imaging <ol><li> Bild des Puppenvorbereitung mit einFluoreszenzmikroskop. Alle 7 min Abscheidung Serienschnitte durch den apikalen Domäne des Auges Neuroepithel, in den Bereich der Adhärenzverbindungen. HINWEIS: a) geeignete Serienschnitte sind in der Regel 4-5 pro Z-Stapel von 0,2 um z-Schritten zusammen. b) Unregelmäßigkeiten in der Topologie des Epithels, einschließlich milde Beulen und Falten, kann es schwierig sein Scharf Bilder von großen Gewebebereiche zu erwerben. Während Bildgebung kann ein Teil eines Bereichs von Interesse zu finden, um in-Fokus, und eine Nachbarregion zu out-of-Fokus. Einschließlich ein kleines Tröpfchen destilliertes Wasser zwischen dem Puppen Auge und Deck einige akute Gewebefalten aber nicht beseitigen die leicht unebenen Topologie Eigenschaft der frühen Stadien der Puppenauge Morphogenese. In diesen Fällen überabzutasten das Gewebe durch die Verlängerung der Z-Stapel, bis Scharf Scheiben werden für den gesamten Bereich erworben. c) Aufnahme von Serienschnitten alle 7 min sollten Live-Bildgebung für 3 bis 4 Stunden ohne signifikante redu aktivierenction in der Intensität der GFP-Fluoreszenz, die die Bildqualität beeinträchtigen können. Kürzere Zeitintervalle können die Gesamtzeit der Bildgebung zu reduzieren. </li><li> Weiter Bildgebung für 3 bis 4 Stunden. Verwenden Sie keinen Autofokus und Zeitfunktion, die auf vielen Fluoreszenz-Mikroskope zur Verfügung steht, da Puppen Wachstum und Pumpen der Hämolymphe bewegt sich die Position der Netzhaut und wachsam Neuausrichtung benötigt jede 14 bis 21 min. Beachten Sie, dass Bildgebung über 4 Stunden kann verlangsamen oder zum Stillstand Morphogenese des Auges. </li><li> Verwenden Sie geeignete Entfaltungssoftware Hintergrund zu verringern und den Kontrast der seriellen Schnittbilder. Für jede Z-Stapel-Datei, führen Sie das folgende in LAS AF Software (siehe Tabelle der Werkstoffe): Wechseln Sie zum Werkzeugfenster, wählen Sie 3D Dekonvolution und klicken Sie auf Übernehmen. </li><li> Erzeugen Sie eine maximale Projektion (MP) für jeden entfaltet Stack-Datei: Navigieren Sie zu der Werkzeugleiste, wählen Sie 3D-Projektion und klicken Sie auf Übernehmen. Hinweis: Die maximale Projektionsalgorithmus kann fehlschlagen, ein einheitliches erzeugenly Bild in-Fokus für Gewebe, die überabgetastete hat. Ein Verfahren zum Schärfen von out-of-focus-Regionen in Schritt 5.2 beschrieben sind. </li></ol> 4. Post-Bildgebung Pupal Rettungs- und Phänotyp Verification <ol><li> Um Adresse, ob Artefakte eingeführt wurden oder die Puppe während der Bildgebung zu Schaden, entfernen Sie vorsichtig die Puppe von der Bild rig: mit einer Pinzette entfernen Sie die Deckglas und übertragen Sie die Puppe in eine saubere Phiole von Lebensmitteln. Bei einer Raumtemperatur oder 25 ° C, bis die erwachsene Fliege auftaucht. </li><li> Sorgfältig prüfen, den Phänotyp der erwachsenen Auge und im Vergleich zu den Augen der erwachsenen Fliegen, die aus dem ursprünglichen Flug Kreuz. </li></ol> 5. Bildverarbeitung <ol><li> Automatische Bildausrichtung: HINWEIS: Die Live Drosophila Gewebe verschieben und zu wachsen in der gesamten Abbildungsprozesses. Folglich sind die Mitten der Bilder gesammelt zu aufeinanderfolgenden Zeitpunkte nicht auf den gleichen Punkt in der Drosophila Gewebe entsprechen. Neben dergesamte Retina Scheibe dreht sich um 30 ° zwischen ~ 21 und 23 h APF. Um einzelne Zelle Verhaltensweisen hervorheben und Ablenkungen durch organismal Wachstum zu reduzieren, richten Sie jeden MP image.While dies kann manuell durchgeführt werden, die Bildbearbeitungs-Software verwendet hier (siehe Tabelle der Materialien) verfügt über eine integrierte Algorithmen, die den Prozess zu beschleunigen kann. <ol><li> Von der Registerkarte Datei im Hauptmenü geöffnet Scripts und wählen Sie Dateien in Stapel laden. </li><li> Importieren Sie die MP-Bilddateien in das Panel laden Layer und wählen Sie OK. Stellen Sie sicher, dass der Versuch, die Bilder-Option Quelle automatisch ausrichten nicht aktiviert ist. HINWEIS: Wenn diese Option aktiviert ist, kann die Software eine Alignment-Algorithmus, der die Bilddaten verfälscht verwenden. </li><li> Sobald alle MP-Dateien in die Ebenen-Fensterbereich geladen werden, um sicherzustellen, dass alle Bilder in chronologischer Reihenfolge, so dass der früheste Zeitpunkt ist an der Spitze des Schichtstapels. Wenn die Schichten nicht in der richtigen Reihenfolge per Drag &amp; Drop, bis sie bestellt werdenrichtig. </li><li> Wählen Ebenen automatisch ausrichten auf der Registerkarte Bearbeiten des Hauptmenüs. Wählen Sie neu positionieren und klicken Sie auf OK. </li><li> Wenn die Auto-Align-Algorithmus nicht den Rahmen zu einem relevanten Schwerpunkt zu orientieren, stellen kleinere Anpassungen mit dem Verschieben-Werkzeug. </li></ol></li><li> Verbundschleif: HINWEIS: Out-of-Schwerpunktregionen eines anfänglichen Bild MP kann durch &quot;Abschneiden&quot; der entsprechende entfaltet Stack in LAS AF Software geschärft werden. Zuschneiden eines Stack-Datei ermöglicht es, den Abstand eines Z-Stapel, der dem Maximum Projektion-Algorithmus unterzogen wird manuell zu beschränken. <ol><li> Suchen Sie die Crop-Funktion in der Werkzeugleiste (unter der Registerkarte Prozess). Manuell begrenzen die ersten und letzten Schichten, so dass sie nur das Haftband im anfänglich außerhalb des Fokusbereichs zu überspannen. Klicken Sie auf Übernehmen, um einen neuen Stapel-Datei, die für diese Region optimiert ist zu generieren. </li><li> Generieren Sie ein neues Maximum Projektion für die lokal optimierte Stack und Export als TIFF-Datei. </li><li> In the Bildbearbeitungs-Software (siehe Tabelle der Materialien), offene Scripts (in der Registerkarte Datei des Hauptmenüs befindet) und wählen Sie Dateien in Stapel laden. </li><li> Importieren Sie die anfängliche Bild MP-Datei und vor Ort optimiert MP-Datei für einen bestimmten Zeitpunkt in das Panel laden Layer und wählen Sie OK. Stellen Sie sicher, dass der Versuch, die Bilder-Option Quelle automatisch ausrichten nicht aktiviert ist. </li><li> Wählen Sie beide Schichten in der Ebenen-Fensterbereich und wählen Sie Ebenen automatisch überblenden (in der Registerkarte Bearbeiten des Hauptmenüs befindet), um die entsprechenden Bereiche der beiden Bilder automatisch zu maskieren, wodurch eine gleichmäßig im Fokus der Netzhaut ein. Sichern Sie das Bild Verbund als TIFF-Datei. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 5.2.1 bis 5.2.5 für alle suboptimalen MP Bilder. </li></ol></li><li> Weitere Einstellmöglichkeiten: drehen, zuschneiden und stellen Sie die Pegel der Film-Schichten: <ol><li> Mit all den Schichten gewählt, verwenden Sie das Transformieren-Werkzeug (Edit&gt; Free Transform), um die Bilder zu drehen, so dass der dorsal-ventralen Achse der Netzhaut ist ausgerichtetzu der y-Achse des Films Rahmen. </li><li> Verwenden Sie gegebenenfalls die Freistellungswerkzeug, um das Sichtfeld auf die gewünschte Größe und Form zu reduzieren. </li><li> Verwenden Pegeleinstellung (von Einzelbildern), die zur Verbesserung Kontrast zwischen der Zellmembran und Zellkörper. </li><li> Für stilistischen Zwecken und an spezifische Zellverhalten zu betonen, stellen Falschfarben zu Sehenswürdigkeiten in jedem Bild zu markieren. </li></ol></li><li> Animation: Konvertieren Sie die Bilder in einen Film: <ol><li> Öffnen Sie das Animationsfenster aus dem Windows-Register des Hauptmenüs. Wählen Stellen Frames von Schichten aus dem Menü in der oberen rechten Ecke des Animationsbereich entfernt. </li><li> Man beachte, dass die Schichten der Animationsfenster in sequentieller Reihenfolge, beginnend von der Unterseite des Stapels hinzugefügt. Um die Reihenfolge der Frames umgekehrt, zunächst alle Bilder auswählen und dann umge Frames aus dem Animationsfenster Menü. </li><li> Wählen Sie eine Bildverzögerungszeit für jedes Bild mit Hilfe der Dropdown-Menü unten am Rahmen DaumenNagel. HINWEIS: Die Frame-Verzögerung für Filme 1 bis 4 in diesem Papier ist 0,8 Sekunden. </li><li> Von der Registerkarte Datei im Hauptmenü geöffnet Export und wählen Sie Video Render. Wählen Sie Quicktime-Export unter Dateioptionen und wählen Sie das gewünschte Videoformat. Unter Render Optionen eingestellt Frame Rate auf Benutzerdefiniert, geben Sie eine Bildrate von 15, und klicken Sie auf Render. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Oda, H., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+cell-cell+adherens+junctions+reveals+that+Drosophila+mesoderm+invagination+begins+with+two+phases+of+apical+constriction+of+cells.">Real-time imaging of cell-cell adherens junctions reveals that Drosophila mesoderm invagination begins with two phases of apical constriction of cells.</a> J. Cell. Sci. 114, 493-501 (2001).</li><li>Oda, H., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+features+of+adherens+junctions+during+Drosophila+embryonic+epithelial+morphogenesis+revealed+by+a+Dalpha-catenin-GFP+fusion+protein.">Dynamic features of adherens junctions during Drosophila embryonic epithelial morphogenesis revealed by a Dalpha-catenin-GFP fusion protein.</a> Dev. Genes Evol. 209, 218-225 (1999).</li><li>Freeman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reiterative+use+of+the+EGF+receptor+triggers+differentiation+of+all+cell+types+in+the+Drosophila+eye.">Reiterative use of the EGF receptor triggers differentiation of all cell types in the Drosophila eye.</a> Cell. 87, 651-660 (1996).</li><li>Cagan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fate+specification+in+the+developing+Drosophila.+retina.">Cell fate specification in the developing Drosophila. retina.</a> Dev Suppl. , 19 (1993).</li><li>Wolff, T., Ready, D. F., Bate, M., Arias, A. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+for+Drosophila+Dicer-1+and+Dicer-2+in+the+siRNA/miRNA+silencing+pathways.">Distinct roles for Drosophila Dicer-1 and Dicer-2 in the siRNA/miRNA silencing pathways.</a> Cell. 117, 69-81 (2004).</li><li>Zitserman, D., Roegiers, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+of+sensory+organ+precursor+cells+in+intact+Drosophila+pupae.">Live-cell imaging of sensory organ precursor cells in intact Drosophila pupae.</a> J. Vis. Exp. (51), 2706 (2011).</li><li>Classen, A. 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Biol. 380, 1-11 (2013).</li><li>Cordero, J., Jassim, O., Bao, S., Cagan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+wingless+in+an+early+pupal+cell+death+event+that+contributes+to+patterning+the+Drosophila+eye.">A role for wingless in an early pupal cell death event that contributes to patterning the Drosophila eye.</a> Mech. Dev. 121, 1523-1530 (2004).</li><li>Larson, D. E., Johnson, R. I., Swat, M., Cordero, J. B., Glazier, J. A., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+simulation+of+cellular+patterning+within+the+Drosophila+pupal+eye.">Computer simulation of cellular patterning within the Drosophila pupal eye.</a> PLoS Comput. Biol. 6, e1000841 (2010).</li><li>Cagan, R. L., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emergence+of+order+in+the+Drosophila+pupal+retina.">The emergence of order in the Drosophila pupal retina.</a> Dev. Biol. 136, 346-362 (1989).</li><li>Cagan, R. L., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+is+required+for+successive+cell+decisions+in+the+developing+Drosophila+retina.">Notch is required for successive cell decisions in the developing Drosophila retina.</a> Genes Dev. 1099, 1112 (1989).</li><li>Miller, D. T., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+induction+of+patterning+and+programmed+cell+death+in+the+developing+Drosophila+retina.">Local induction of patterning and programmed cell death in the developing Drosophila retina.</a> Development. 125, 2327-2335 (1998).</li><li>Sawamoto, K., Okano, H., Kobayakawa, Y., Hayashi, S., Mikoshiba, K., Tanimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+function+of+argos+in+regulating+cell+fate+decisions+during+Drosophila+eye+and+wing+vein+development.">The function of argos in regulating cell fate decisions during Drosophila eye and wing vein development.</a> Dev. Biol. 164, 267-276 (1994).</li><li>Yu, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pathway+of+signals+regulating+effector+and+initiator+caspases+in+the+developing+Drosophila+eye.">A pathway of signals regulating effector and initiator caspases in the developing Drosophila eye.</a> Development. 129, 3269-3278 (2002).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+tugging+force+regulates+the+size+of+cell-cell+junctions.">Mechanical tugging force regulates the size of cell-cell junctions.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 107, 9944-9949 (2010).</li><li>Miyake, Y., Inoue, N., Nishimura, K., Kinoshita, N., Hosoya, H., Yonemura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actomyosin+tension+is+required+for+correct+recruitment+of+adherens+junction+components+and+zonula+occludens+formation.">Actomyosin tension is required for correct recruitment of adherens junction components and zonula occludens formation.</a> Exp. Cell Res. 312, 1637-1650 (2006).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Die Beschreibung der Wildtyp-Entwicklung (siehe oben) ist die Basis für Vergleiche der Strukturierung Ereignisse in RNAi oder Überexpression Genotypen. Vergleiche von lebenden Gewebeentwicklung sind von unschätzbarem Wert, wenn genau zu bestimmen, welcher Zellverhalten werden durch ein Protein von Interesse reguliert. Weitere und hier nicht beschrieben, ermöglicht Live Cell Imaging eine qualitative und / oder quantitative Beschreibungen der Rolle eines Gens von Interesse in den Ereignissen, die Muster das Auge zu ma...

Die Verbindung Drosophila Auge wird durch die stereotype Anordnung seiner ~ 750 Ommatidien von einem Wabengitter von Zubehörpigmentzellen 4,5 getrennt sind. Lokale Zellbewegungen, Zellwachstum, die Veränderungen in der Zellform und Apoptose: Diese Pigmentzellen werden durch eine koordinierte Kombination von Ereignissen gemustert. Live-Anzeige dieser Epithel ermöglicht es, die molekularen Mechanismen, auf denen diese Ereignisse in einem physiologisch relevanten und gelassen dreidimensionalen Kontext zu untersuchen. Im Gegensatz zu bisherigen Protokolle 6,7, die Technik hier skizzierten umfasst ein effizientes Verfahren zum Stabilisieren von äußerem Gewebe Bewegung, die nicht entkoppelt von dem Abbildungsprozess sein kann. Dieses Verfahren verbessert die Untersuchungen des Zellverhaltens in dem Entwicklungs Drosophila Puppenauge Epithel - einem Gewebe wächst dreht und verschiebt sich im Laufe der Bildverarbeitung. Neben der Bewegungsstabilisierungstechnik dehier beschrieben wird zur Untersuchung von Zellen in anderen Zusammenhängen, wo Fremdbewegung auftritt. Um Zellgrenzen in der Netzhautfeld Drosophila sichtbar zu machen, wurden transgene Fliegenlinien erzeugt, die ubi-DE-Cadherin Ausdruck: GFP sowie UAS-α-Catenin: GFP unter Kontrolle des Auges spezifischen Treiber GMR-GAL4 1-3. Die Verwendung von zwei GFP-markierten Membranmarker erlaubt die Visualisierung von Zellgrenzen zu niedrigeren Lichtintensität. Dies minimiert Gewebeschäden und Photobleaching auf wiederholte Exposition gegenüber Hochenergiewellenlängen, so dass erhöhte Bildrate und Filmdauer. Zur Verbesserung der Wirksamkeit der RNAi-Transgene, UAS-DCR-2 wurde auch in eine zweite Fliege Linie 8 eingearbeitet. In einem dritten Update von früheren Protokollen wird ein einfacher Bild rig, die leicht in den meisten Labors zusammengesetzt beschrieben. Diese Vorrichtung vermeidet die Erfordernis, eine spezielle Abbildungs ​​r habenig von einer Universität &quot;Werkstatt&quot; oder ähnlichen Dienst generiert. Diese Bild rig ist ähnlich wie die Bild anderen Puppen Gewebe 9,10 verwendet. Präsentiert hier ist eine einfache Live-Cell-Imaging-Protokoll, das verwendet werden kann, um direkt bewerten die morphogenetischen Ereignisse, die zu Augen Strukturierung von ~ 17 bis 42 Stunden nach der Pupariumbildung (hr APF) beitragen. Insbesondere ermöglicht es dieses Protokoll, um die Konsequenzen der Modifizierung Genexpression während Puppenentwicklung zu bestimmen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="672">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:124px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="3" height="21" style="height:21px;">GMR-GAL4; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP ; + / SM5-TM6b</td>
			<td>Available on request from authors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="3" height="21" style="height:21px;">UAS-dcr-2; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP; + / SM5-TM6b&#160;</td>
			<td>Available on request from authors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Scotch double stick tape</td>
			<td style="width:124px;">3M</td>
			<td style="width:119px;">665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Black Sylgard dissection dish</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Fill glass petri dish to rim with Sylgard (colored black with finely-ground charcoal powder) or Sylgard 170; leave at room temperature for 24-48 h to polymerize</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Sylgard</td>
			<td style="width:124px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:119px;">SYLG184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Sylgard (Black)</td>
			<td style="width:124px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:119px;">SYLG170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Glass petri dish</td>
			<td style="width:124px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">7220-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">25 x 75 x 1 mm glass microscope slide</td>
			<td style="width:124px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-550-413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">22 x 40 mm glass coverslip</td>
			<td style="width:124px;">VWR</td>
			<td>48393-172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">Forceps&#160;</td>
			<td style="width:124px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">Whatman 3mm Chromatography Paper</td>
			<td style="width:124px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">05-713-336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Vaseline</td>
			<td style="width:124px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">19-086-291</td>
			<td>Or purchase at local pharmacy.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">30ml syringe</td>
			<td style="width:124px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S7510-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Adobe Photoshop CS5</td>
			<td style="width:124px;">Adobe</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">Leica TCS SP5 DM microscope</td>
			<td style="width:124px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">LAS AF Version 2.6.0.7266 microscope software</td>
			<td style="width:124px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live-imaging of the drosophila pupal eye

Inhärenten Prozesse der Drosophila Puppenentwicklung können sich verschieben und verdrehen die Augen Epithel in einer Weise, die einzelnen Zellverhalten schwer in lebenden Zellen zu verfolgen, zu machen. Diese Prozesse umfassen: Netzhautrotation, das Zellwachstum und organismischen Bewegung. Zusätzlich Falten Unregelmäßigkeiten in der Topologie des Epithels, einschließlich feinen Unebenheiten und oft eingeführt, wie die Puppe zur Abbildung hergestellt, es schwer machen, in unscharfe Bilder von mehr als ein paar Ommatidien in einer einzigen Brennebene zu erwerben. Der Workflow skizzierten Heil diese Fragen, was eine einfache Analyse zellulärer Prozesse bei Drosophila Puppenaugenentwicklung. Passenderstufigen Puppen sind in einem bildgebenden rig, die leicht in den meisten Labors montiert werden kann angeordnet Ubiquitin-DE-Cadherin. GFP und GMR-GAL4 -driven UAS-α-Catenin: GFP werden verwendet, um Zellgrenzen im Auge Epithel 1 visualisieren -3. Nach Dekonvolution istFluoreszenzbildern mit mehreren Fokusebenen erfasst angewendet werden maximale Projektionsbilder für jeden Zeitpunkt erzeugt und verstärkt mit einer Bildbearbeitungssoftware. Alignment-Algorithmen verwendet werden, um schnell zu stabilisieren flüssige Bewegung, so dass einzelne Zelle Verhalten leichter zu verfolgen.

Live-Bildgebung des Puppen Auge ist eine erfolgreiche Strategie zur Zelle Verhaltensweisen, die Strukturierung der Neuroepithel beitragen beobachten. Die Rolle von spezifischen Proteinen kann leicht durch Expression von Transgenen, die während der Entwicklung des Auges Protein-Ebene ändern zu bewerten. Um dieses GMR-GAL4 tun wird zur Expression des Transgens hinter dem morphogenetischen Furche fahren. Dies bietet den Vorteil, nicht zu stören früheren Veranstaltungen, die das Auge Bereich in den ersten beide...

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Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Live-Bilder aus dem<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupal Augen

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

9.3K Aufrufe.  Wesleyan University. This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Serie: Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

Langfristige Live-Imaging von<em&gt; Drosophila</em&gt; Augen Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

Wing development in Drosophila melanogaster is an ideal model for studying morphogenesis at tissue level. These appendages develop from a group of cells named wing imaginal discs formed during embryonic development. In the larval stages the imaginal discs grow, increasing its number of cells and forming monolayered epithelial&#160;structures. Inside the pupal case, the imaginal discs bud out and fold into bilayers along a line that becomes the future margin of the wing. During this process, the longitudinal primodia veins originate vein cells on the prospective dorsal and ventral surfaces of the wing. During the pupal stage the stripes of vein cells of each surface communicate in order to generate tight tubes; at the same time, the cross-veins begin their formation.
With the help of appropriate molecular markers, it is possible to identify the major elements composing the wing during its development. For this reason, the ability to accurately detect transcripts or proteins in this structure is critical for studying their abundance and localization related to the development process of the wing.
The procedure described here focuses on manipulating pupal wings, providing detailed instructions on how to dissect the wing during the pupal stage. The dissection of pupal tissue is more difficult to perform than their counterparts in third instar larvae. This is why this approach was developed, to obtain rapid and efficient high quality samples. Details of how to immunostain and mount these wing samples, to allow the visualization of proteins or cell components, are provided in the protocol. With little expertise it is possible to collect 8-10 high quality pupal wings in a short amount of time.

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

The ability to accurately detect transcripts or proteins in Drosophila tissues is critical for studying their abundance and localization related to the development process. Here is the description of a straightforward procedure to dissect pupal wings. These wings can be used as samples in several techniques (immunohistochemistry, PCR assay, etc.).

Eine schnelle und effiziente Methode, um Pupal Flügel von Drosophila geeignet für Immunodetections oder PCR-Assays sezieren

Wing development in Drosophila melanogaster is an ideal model for studying morphogenesis at tissue level. These appendages develop from a group of cells ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

Bioengineering von humanisierten Knochenmark-Mikroumgebungen in der Maus und ihre Visualisierung durch Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Live Imaging der Maus Sekundärer Gaumen Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a pupal case. The challenge of dissecting pupal ovaries also lies in their physical location within the pupa: the ovaries are surrounded by fat body cells inside the pupal abdomen, and these fat cells must be removed to allow for proper antibody staining. To overcome these challenges, this protocol utilizes customized Pasteur pipets to extract fat body cells from the pupal abdomen. Moreover, a chambered coverglass is used in place of a microcentrifuge tube during the staining process to improve visibility of the pupae. However, despite these and other advantages of the tools used in this protocol, successful execution of these techniques may still involve several days of practice due to the small size of pupal ovaries. The techniques outlined in this protocol could be applied to time course experiments in which ovaries are analyzed at various stages of pupal development.

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

The Drosophila ovary is an excellent model system for studying stem cell niche development. Though methods for dissecting larval and adult ovaries have been published, pupal ovary dissections require different techniques that have not been published in detail. Here we outline a protocol for dissecting, staining, and mounting pupal ovaries.

Präparation und Färbung von Drosophila Pupal Eierstöcke

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a reliable protocol for the dissection of the delicate Drosophila pupal retina. Our surgical approach utilizes readily-available microdissection tools to open pupae and precisely extract eye-brain complexes. These can be fixed, subjected to immunohistochemistry, and retinas then mounted onto microscope slides and imaged if the goal is to detect cellular or subcellular structures. Alternatively, unfixed retinas can be isolated from brain tissue, lysed in appropriate buffers and utilized for protein gel electrophoresis or mRNA extraction (to assess protein or gene expression, respectively). Significant practice and patience may be required to master the microdissection protocol described, but once mastered, the protocol enables relatively quick isolation of mainly undamaged retinas.

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

This paper presents a surgical method for dissecting Drosophila pupal retinas along with protocols for the processing of tissue for immunohistochemistry, western analysis, and RNA-extraction.&#160;

Dissektion der Drosophila Pupal Netzhaut Immunohistochemistry, westlichen Analyse und RNA-Isolation

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits are required to control this behavior. Failure to produce the rhythmic pattern of contractions can be indicative of neurological abnormalities. We previously found that defects in protein O-mannosylation, a posttranslational protein modification, affect the axon morphology of sensory neurons and result in abnormal coordinated muscle contractions in embryos. Here, we present a relatively simple method for recording and analyzing the pattern of peristaltic muscle contractions by live imaging of late stage embryos up to the point of hatching, which we used to characterize the muscle contraction phenotype of protein O-mannosyltransferase mutants. Data obtained from these recordings can be used to analyze muscle contraction waves, including frequency, direction of propagation and relative amplitude of muscle contractions at different body segments. We have also examined body posture and taken advantage of a fluorescent marker expressed specifically in muscles to accurately determine the position of the embryo midline. A similar approach can also be utilized to study various other behaviors during development, such as embryo rolling and hatching.

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Here, we present a method to record embryonic muscle contractions in Drosophila embryos in a non-invasive and detail-oriented manner.

Live Imaging und Analyse von Muskelkontraktionen im Drosophila-Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the number of novel cell lines is expected to increase. The DGRC aims to familiarize researchers with using Drosophila cell lines as an experimental tool to complement and drive their research agenda. Procedures for working with a variety of Drosophila cell lines with distinct characteristics are provided, including protocols for thawing, culturing, and cryopreserving cell lines. Importantly, this publication demonstrates the best practices required to work with Drosophila cell lines to minimize the risk of contaminations from adventitious microorganisms or from other cell lines. Researchers who become familiar with these procedures will be able to delve into the many applications that use Drosophila cultured cells including biochemistry, cell biology and functional genomics.

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Drosophila cell lines are important reagents for both fundamental and biomedical research. This article provides protocols for thawing, subculturing, and the cryopreservation of commonly used Drosophila cell lines to assist researchers in incorporating the use of these reagents in their research.

Auftauen, Kultivierung und Cryopreserving Drosophila -Zell-Linien

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A remarkable example is given by sensory epithelia, where cells of the same or distinct identities are brought together via cell-cell adhesion showing highly organized planar patterns. Cells align to one another in the same direction and display equivalent polarity over large distances. This organization of the mature epithelia is established over the course of morphogenesis. To understand how the planar arrangement of the mature epithelia is achieved, it is crucial to track cell orientation and growth dynamics with high spatiotemporal fidelity during development in vivo. Robust analytical tools are also essential to identify and characterize local-to-global transitions. The Drosophila pupa is an ideal system to evaluate oriented cell shape changes underlying epithelial morphogenesis. The pupal developing epithelium constitutes the external surface of the immobile body, allowing long-term imaging of intact animals. The protocol described here is designed to image and analyze cell behaviors at both global and local levels in the pupal abdominal epidermis as it grows. The methodology described can be easily adapted to the imaging of cell behaviors at other developmental stages, tissues, subcellular structures, or model organisms.

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

This protocol is designed for the imaging and analysis of the dynamics of cell orientation and tissue growth in the Drosophila abdominal epithelia as the fruit fly undergoes metamorphosis. The methodology described here can be applied to the study of different developmental stages, tissues, and subcellular structures in Drosophila or other model organisms.

Bildgebung und Analyse der Gewebeorientierung und Wachstumsdynamik in der Entwicklung drosophila Epithelia während der Pupal-Stadien

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with development, tissue homeostasis, and disease processes. Drosophila spermatocytes undergoing meiosis are ideal for this analysis because (1) whole Drosophila testes containing spermatocytes are relatively easy to prepare for microscopy, (2) the spermatocytes&#8217; large size makes them well suited for high resolution imaging, and (3) powerful Drosophila genetic tools can be integrated with in vivo analysis. Here, we present a readily accessible protocol for the preparation of whole testes from Drosophila third instar larvae and early pupae. We describe how to identify meiotic spermatocytes in prepared whole testes and how to image them live by time-lapse microscopy. Protocols for fixation and immunostaining whole testes are also provided. The use of larval testes has several advantages over available protocols that use adult testes for spermatocyte analysis. Most importantly, larval testes are smaller and less crowded with cells than adult testes, and this greatly facilitates high resolution imaging of spermatocytes. To demonstrate these advantages and the applications of the protocols, we present results showing the redistribution of the endoplasmic reticulum with respect to spindle microtubules during cell division in a single spermatocyte imaged by time-lapse confocal microscopy. The protocols can be combined with expression of any number of fluorescently tagged proteins or organelle markers, as well as gene mutations and other genetic tools, making this approach especially powerful for analysis of cell division mechanisms in the physiological context of whole tissues and organs.

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

The goal of this protocol is to analyze cell division in intact tissue by live and fixed cell microscopy using Drosophila meiotic spermatocytes. The protocol demonstrates how to isolate whole, intact testes from Drosophila larvae and early pupae, and how to process and mount them for microscopy.

Vorbereitung von Drosophila Larval und Pupal Hoden für die Analyse der Zellteilung in Leben, intaktes Gewebe

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...