Unsere Forschung verwendet optogenetische Werkzeuge, um zu untersuchen, wie neuronale Schaltkreise in Drosophila melanogaster Verhaltensweisen wie Thermotaxis und Schwangerschaft steuern. Durch die Steuerung bestimmter Neuronen mit Licht wollen wir verstehen, wie diese Schaltkreise sensorische Reaktionen steuern und die Entscheidungsfindung mit hoher Präzision beeinflussen. Die Optogenetik ist eine wertvolle Technologie in den Neurowissenschaften, die eine präzise Steuerung der neuronalen Aktivität mit Hilfe von Licht ermöglicht.
In Drosophila melanogaster ermöglichen Werkzeuge wie CsChrimson und GtACR2 die gezielte Aktivierung und Hemmung von Neuronen. Diese Werkzeuge ermöglichen es Forschern, neuronale Schaltkreise zu manipulieren, Verhalten zu untersuchen und Sensorreaktionen mit hoher Spezifität zu untersuchen. Unser Protokoll bietet einen einfachen, kostengünstigen und reproduzierbaren Ansatz zur optogenetischen Manipulation bei Drosophila.
Es verwendet kommerziell erhältliche Materialien, so dass es in Laboren und Klassenzimmern mit begrenzten Ressourcen zugänglich ist. Die Methoden sind zudem sehr anpassungsfähig und ermöglichen die Untersuchung von Attraktiv- und Vermeidungsverhalten mit minimalen technischen Herausforderungen. Zu Beginn erhalten Sie männliche und weibliche Drosophila-Fliegen, die GtACR2 in Heizzellen exprimieren.
Richten Sie zwei Stahlplatten auf separaten Kochplatten so aus, dass sich ihre Kanten treffen. Legen Sie eine Plastikfolie darauf und befestigen Sie sie mit Klebeband, um Bewegungen zu minimieren. Positionieren Sie nun ein weißes Blatt Papier auf der Schutzfolie, um Hintergrundgeräusche zu reduzieren, und legen Sie eine durchsichtige Plastikabdeckung auf das weiße Papier.
Schneiden Sie dann ein Loch in den Boden einer Styropor-Schaumstoffbox, um die Kamera und das blaue Licht etwa 12 Zentimeter über der Versuchsfläche aufzunehmen. Positionieren Sie die Kamera und das blaue Licht, um Blendung zu minimieren und gleichzeitig die Aktivierung zu gewährleisten. Stellen Sie die Kamera so ein, dass sie mit einem Zeitraffer von einer Sekunde, einem schmalen Bildfeld und einer Auflösung von 4.000 x 3.000 Pixeln aufzeichnet.
Passen Sie die Kochplatteneinstellungen so an, dass eine Oberflächentemperatur von 25 plus oder minus einem Grad Celsius und 31 plus oder minus einem Grad Celsius auf den jeweiligen Stahlplatten gehalten wird. Überwachen Sie die Temperaturen der Stahlplatten mit einem Oberflächentemperaturfühler vor und nach jedem Versuch. Platzieren Sie anschließend die Kunststoffabdeckung auf der 25 Grad Celsius heißen Stahlplatte.
Lassen Sie nun mit einem Fliegensauger vorsichtig eine einzelne Fliege unter der Abdeckung los. Positionieren Sie die Box über dem Versuchsbereich, um schwaches Licht unter 10 Lux zu erzeugen, und lassen Sie die Fliege eine Minute lang akklimatisieren. Heben Sie nach der Eingewöhnungsphase die Box an und stellen Sie die Kunststoffabdeckung schnell so ein, dass die Mitte der Abdeckung mit der Stahlplattenbegrenzung ausgerichtet ist.
Starten Sie die Testversion, schalten Sie die Kamera ein und leuchten Sie mit blauem Licht bei 20 Kilolux. Erfassen Sie die Aktivität der Fliegen für zwei Minuten. Schalten Sie nach zwei Minuten die Kamera und das Licht aus.
Entsorgen Sie die Fliegen mit dem Sauger. Betäuben Sie ausgehungerte männliche und weibliche Fliegen, die CsChrimson in Rezeptorneuronen für süßen Geschmack auf Eis exprimieren. Tragen Sie sieben bis 10 kleine Punkte Kleber auf einen Objektträger auf.
Positionieren Sie eine Fliege mit der Bauchseite nach oben auf jedem Klebepunkt und stellen Sie sicher, dass der Brustkorb und die Flügel den Kleber berühren, um Bewegungen zu minimieren. Fächern Sie die Flügel zu jeder Seite auf, um die Klebefläche zu vergrößern. Legen Sie feuchte Papiertücher in eine Feuchtigkeitsbox und geben Sie die Objektträger in die Box.
Legen Sie den Objektträger nach zwei Stunden Genesung unter das Mikroskop. Verwenden Sie eine Spritze, um einen Tropfen Wasser zu verabreichen, um die Fliegen zu sättigen und durstbedingte Rüsselausdehnungen zu verhindern. Halten Sie manuell einen roten Laserpointer und leuchten Sie mit rotem Licht auf den Rüssel oder Kopf einer einzelnen Fliege mit 700 Lux.
Beobachten Sie die Reaktion der Rüsselverlängerung durch das Mikroskop innerhalb eines 30-Sekunden-Fensters. Nach dem Testen der lichtinduzierten Rüsselverlängerung untersuchen Sie die Reaktion auf 4%Saccharose. Stoßen Sie ein Tröpfchen Saccharose am Ende der Spritzennadel aus und bringen Sie es in die Nähe des Rüssels der Fliege.
Baue zuerst das Fliegenlabyrinth für das Experiment zusammen. Bei Dunkelheit oder schlechten Lichtverhältnissen werden 10 männliche und 10 weibliche CsChrimson-exprimierende Fliegen in das Laderohr eingesetzt und mit der Haltekammer verbunden. Kippen Sie den Aufzug und klopfen Sie vorsichtig auf das Rohr, um die Fliegen in die Haltekammer zu befördern.
Nachdem Sie die Fliegen in die Haltekammer gebracht haben, verwenden Sie den Aufzug, um sie zwischen dem Laderohr und den Löchern des Testrohrs abzusenken. Entfernen Sie dann das Laderohr. Positionieren Sie das Fliegenlabyrinth etwa 13 Zentimeter von der roten Lichtquelle mit 1.000 Milliampere entfernt, ohne das Licht einzuschalten.
Senken Sie den Elevator ab, bis die Haltekammer mit den Löchern des Reagenzglases ausgerichtet ist, damit sich die Fliegen frei zwischen den mit Folie umwickelten und unbedeckten Reagenzgläsern bewegen können. Schalten Sie gleichzeitig das rote Licht bei ca. 40 Kilolux ein, um CsChrimson zu aktivieren. Lassen Sie die Fliegen eine Minute lang zwischen der rotlichtbelichteten Röhre und der schattigen Röhre wählen.
Heben Sie nach einer Minute den Aufzug zwischen dem Laderohr und den Prüfrohrlöchern an. Entferne die Fliegen aus jedem Röhrchen. Zählen Sie sie und notieren Sie die Zahlen.
Reinige das Fliegenheber und das Fliegenlabyrinth nach jedem Versuch mit destilliertem Wasser. Im Blaulicht-, optogenetischen, thermotaktischen Positionspräferenz-Assay mieden die Fliegen unter den Kontrollbedingungen die 31-Grad-Celsius-Seite, während die Fliegen bei blauem Licht mit ATR-Supplementierung keine Präferenz zwischen 25 und 31 Grad Celsius zeigten, was auf eine Hemmung der HC-Neuronen über die GtACR2-Aktivierung hinweist. Unter Kontrollbedingungen zeigten die Fliegen eine minimale Reaktion auf die Rüsselverlängerung, während die Aktivierung von Rotlicht mit ATR-Supplementierung zu einer signifikanten Rüsselverlängerung führte, was die Aktivierung von Sweet-Sensing-Neuronen durch CsChrimson zeigt.
Im optogenetischen Rotlicht-Fliegenlabyrinth-Assay zeigten die Kontrollgruppen keine Präferenz, während die Rotlichtaktivierung mit ATR-Supplementierung dazu führte, dass Fliegen die unbedeckte Röhre mieden, was auf eine bitterempfindliche Neuronenaktivierung durch CsChrimson hinweist.
