11.22 : Cromatografía de exclusión por tamaño

En la cromatografía de exclusión molecular (SEC), también conocida como cromatografía de exclusión molecular o cromatografía de permeación en gel, las moléculas se separan en función de su tamaño. Esta técnica es importante para separar moléculas grandes, como polímeros y biomoléculas. Las dos clases de fases estacionarias de tamaño micrométrico que se encuentran en la SEC son partículas de sílice y perlas de resina polimérica reticulada. Ambos materiales son porosos, pero el tamaño de sus poros varía significativamente.

Las partículas de sílice ofrecen ventajas como rigidez, estabilidad y compatibilidad con varios solventes. Por el contrario, las perlas de polímero vienen en diferentes tamaños de poro y pueden ser hidrófilas (amantes del agua) o hidrófobas (repelen el agua). Los geles hidrófilos como el agar y la poliacrilamida se utilizan para separaciones acuosas, mientras que los geles hidrófobos como el poliestireno-divinilbenceno son los preferidos para solventes no polares. Las partículas de sílice utilizadas para la exclusión por tamaño se desactivan para evitar interacciones no deseadas, mientras que las resinas poliméricas se sintetizan sin sitios de intercambio.

Los solutos más pequeños pasan más tiempo dentro de los poros de la fase estacionaria, lo que da como resultado un tiempo de elución más prolongado de la columna. El volumen de retención de un soluto depende de su relación de distribución, que varía de 0 en el límite de exclusión a 1 en el límite de inclusión. Esto refleja qué tan bien penetra el soluto en los poros.

La SEC es una aplicación destacada en el análisis de mezclas de proteínas y la determinación de pesos de fórmulas. Se pueden preparar curvas de calibración entre los límites de exclusión e inclusión, pero para determinar con precisión el peso de las fórmulas es necesario elegir cuidadosamente los estándares para minimizar el efecto de la forma.

Esta técnica se puede llevar a cabo utilizando instrumentación HPLC convencional, reemplazando la columna HPLC por una columna de exclusión por tamaño adecuada. Normalmente se utiliza un detector UV/Vis para obtener cromatogramas.