11.22 : Cromatografia de Exclusão de Tamanho

Na cromatografia por exclusão de tamanho (SEC), também conhecida como cromatografia de exclusão molecular ou de permeação em gel, as moléculas são separadas com base em seus tamanhos. Essa técnica é importante para separar moléculas grandes, como polímeros e biomoléculas. As duas classes de fases estacionárias de tamanho micrométrico encontradas na SEC são partículas de sílica e esferas de resina de polímero reticulado. Ambos os materiais são porosos, mas os tamanhos dos seus poros variam significativamente.

As partículas de sílica oferecem vantagens como rigidez, estabilidade e compatibilidade com vários solventes. Em contraste, as esferas de polímero vêm em diferentes tamanhos de poros e podem ser hidrofílicas (que atraem água) ou hidrofóbicas (que repelem água). Géis hidrofílicos como ágar e poliacrilamida são usados ​​para separações aquosas, enquanto géis hidrofóbicos como poliestireno-divinilbenzeno são preferidos para solventes não polares. Partículas de sílica usadas para exclusão de tamanho são desativadas para evitar interações indesejadas, enquanto resinas de polímero são sintetizadas sem locais de troca.

Solutos menores passam mais tempo dentro dos poros da fase estacionária, resultando em um tempo de eluição mais longo da coluna. O volume de retenção para um soluto depende de sua taxa de distribuição, que varia de 0 no limite de exclusão a 1 no limite de inclusão. Isso reflete o quão bem o soluto penetra nos poros.

A SEC é uma aplicação notável na análise de misturas de proteínas e na determinação de pesos de fórmula. Curvas de calibração podem ser preparadas entre os limites de exclusão e inclusão, mas determinações precisas de peso de fórmula requerem padrões cuidadosamente escolhidos para minimizar o efeito da forma.

Esta técnica pode ser aplicada utilizando instrumentação HPLC convencional, substituindo a coluna HPLC por uma coluna de exclusão de tamanho apropriada. Um detector UV/Vis é normalmente utilizado para obter cromatogramas.