11.22 : Chromatographie d'exclusion stérique

Dans la chromatographie d'exclusion stérique (SEC), également connue sous le nom de chromatographie d'exclusion moléculaire ou de chromatographie par perméation de gel, les molécules sont séparées en fonction de leur taille. Cette technique est importante pour séparer les grosses molécules telles que les polymères et les biomolécules. Les deux classes de phases stationnaires de la taille du micron rencontrées dans la SEC sont les particules de silice et les billes de résine polymère réticulée. Les deux matériaux sont poreux, mais leurs tailles de pores varient considérablement.

Les particules de silice offrent des avantages tels que la rigidité, la stabilité et la compatibilité avec divers solvants. En revanche, les billes de polymère ont différentes tailles de pores et peuvent être hydrophiles (aimant l'eau) ou hydrophobes (repoussant l'eau). Les gels hydrophiles comme l'agar et le polyacrylamide sont utilisés pour les séparations aqueuses, tandis que les gels hydrophobes comme le polystyrène-divinylbenzène sont préférés pour les solvants non polaires. Les particules de silice utilisées pour l'exclusion stérique sont désactivées pour éviter les interactions indésirables, tandis que les résines polymères sont synthétisées sans sites d'échange.

Les solutés plus petits passent plus de temps dans les pores de la phase stationnaire, ce qui entraîne un temps d'élution plus long de la colonne. Le volume de rétention d'un soluté dépend de son rapport de distribution, qui varie de 0 à la limite d'exclusion à 1 à la limite d'inclusion. Cela reflète la façon dont le soluté pénètre dans les pores.

La SEC est une application notable dans l'analyse des mélanges de protéines et la détermination des poids de formule. Des courbes d'étalonnage peuvent être préparées entre les limites d'exclusion et d'inclusion, mais des déterminations précises du poids de la formule nécessitent des normes soigneusement choisies pour minimiser l'effet de la forme.

Cette technique peut être réalisée à l'aide d'instruments HPLC conventionnels en remplaçant la colonne HPLC par une colonne d'exclusion de taille appropriée. Un détecteur UV/Vis est généralement utilisé pour obtenir des chromatogrammes.