11.22 : Größenausschlusschromatographie

Bei der Größenausschlusschromatographie (SEC), auch bekannt als Molekularausschluss- oder Gelpermeationschromatographie, werden Moleküle anhand ihrer Größe getrennt. Diese Technik ist wichtig für die Trennung großer Moleküle wie Polymere und Biomoleküle. Die beiden Klassen von mikrometergroßen stationären Phasen, die bei der SEC vorkommen, sind Silicapartikel und vernetzte Polymerharzkügelchen. Beide Materialien sind porös, jedoch variieren ihre Porengrößen erheblich.

Silicapartikel bieten Vorteile wie Steifigkeit, Stabilität und Kompatibilität mit verschiedenen Lösungsmitteln. Im Gegensatz dazu gibt es Polymerkügelchen in unterschiedlichen Porengrößen und sie können hydrophil (wasserliebend) oder hydrophob (wasserabweisend) sein. Hydrophile Gele wie Agar und Polyacrylamid werden für wässrige Trennungen verwendet, während hydrophobe Gele wie Polystyrol-Divinylbenzol für unpolare Lösungsmittel bevorzugt werden. Silicapartikel, die für den Größenausschluss verwendet werden, sind deaktiviert, um unerwünschte Wechselwirkungen zu verhindern, während Polymerharze ohne Austauschstellen synthetisiert werden. 

Kleinere gelöste Stoffe verbringen mehr Zeit in den Poren der stationären Phase, was zu einer längeren Elutionszeit aus der Säule führt. Das Retentionsvolumen für einen gelösten Stoff hängt von seinem Verteilungsverhältnis ab, das von 0 an der Ausschlussgrenze bis 1 an der Einschlussgrenze reicht. Dies spiegelt wider, wie gut der gelöste Stoff in die Poren eindringt.

Die SEC ist eine bemerkenswerte Methode bei der Analyse von Proteinmischungen und der Bestimmung von Formelmassen. Kalibrierungskurven können zwischen den Ausschluss- und Einschlussgrenzen erstellt werden, aber genaue Formelmassenbestimmungen erfordern sorgfältig ausgewählte Standards, um den Einfluss der Form zu minimieren.

Diese Technik kann mit herkömmlichen HPLC-Instrumenten durchgeführt werden, indem die HPLC-Säule durch eine geeignete Größenausschlusssäule ersetzt wird. Normalerweise wird ein UV/Vis-Detektor verwendet, um Chromatogramme zu erhalten.