11.22 : Chromatografia wykluczania wielkościowego

W chromatografii wykluczania wielkościowego (SEC), znanej również jako chromatografia wykluczania cząsteczkowego lub chromatografia żelowo-permeacyjna, cząsteczki są rozdzielane na podstawie ich rozmiarów. Ta technika jest ważna w przypadku rozdzielania dużych cząsteczek, takich jak polimery i biocząsteczki. Dwiema klasami faz stacjonarnych o wielkości mikronów spotykanymi w SEC są cząstki krzemionki i usieciowane kulki żywicy polimerowej. Oba materiały są porowate, ale ich rozmiary porów znacznie się różnią.

Cząsteczki krzemionki oferują zalety, takie jak sztywność, stabilność i zgodność z różnymi rozpuszczalnikami. Natomiast kulki polimerowe mają różne rozmiary porów i mogą być hydrofilowe (lubiące wodę) lub hydrofobowe (odpychające wodę). Żele hydrofilowe, takie jak agar i poliakrylamid, są używane do rozdzielania w wodzie, podczas gdy żele hydrofobowe, takie jak polistyren-diwinylobenzen, są preferowane w przypadku rozpuszczalników niepolarnych. Cząsteczki krzemionki używane do wykluczania wielkości są dezaktywowane, aby zapobiec niepożądanym interakcjom, podczas gdy żywice polimerowe są syntetyzowane bez miejsc wymiany.

Mniejsze substancje rozpuszczone spędzają więcej czasu w porach fazy stacjonarnej, co skutkuje dłuższym czasem elucji z kolumny. Objętość retencji substancji rozpuszczonej zależy od jej współczynnika dystrybucji, który waha się od 0 na granicy wykluczenia do 1 na granicy inkluzji. ​​Odzwierciedla to, jak dobrze substancja rozpuszczona przenika przez pory.

SEC jest godnym uwagi zastosowaniem w analizie mieszanin białek i określaniu wag formuły. Krzywe kalibracji można przygotować między granicami wykluczenia i inkluzji, ale dokładne określenie wag formuły wymaga starannie dobranych standardów w celu zminimalizowania wpływu kształtu.

Tę technikę można przeprowadzić przy użyciu konwencjonalnej aparatury HPLC, zastępując kolumnę HPLC odpowiednią kolumną wykluczania wielkości. Do uzyskania chromatogramów zwykle stosuje się detektor UV/Vis.Chromatografia wykluczania wielkościowego