Un método para la encapsulación de los folículos ováricos y la Cultura en un proteolíticamente degradables tres dimensiones del sistema

Resumen

Un nuevo método para la encapsulación de los folículos ováricos en 3D de fibrina-alginato red interpenetrante se describe. Este sistema combina un soporte estructural a la degradación proteolítica de apoyar el desarrollo de folículos inmaduros para producir ovocitos maduros. Este método puede ser aplicado a los agregados de cultivo celular para mantener contactos célula-célula, sin limitar la expansión.

Resumen

El folículo ovárico es la unidad funcional del ovario que segrega las hormonas sexuales y apoya la maduración de ovocitos. En las técnicas in vitro de folículos proporcionar una herramienta para el desarrollo del folículo modelo para investigar la biología básica, y además se está desarrollando como una técnica para preservar la fertilidad en el clínica ^1-4. Nuestro sistema de cultivo in vitro cuenta con hidrogeles con el fin de imitar el ambiente de ovario nativos mediante el mantenimiento de la arquitectura folicular en 3D, interacciones célula-célula y la señalización paracrina que el desarrollo del folículo directa ^5. Anteriormente, los folículos se cultivaron con éxito en alginato, un derivado de algas inertes polisacárido que se somete a la gelificación de los iones de calcio ^6-8. Hidrogeles de alginato forma a una concentración de 0,25% w / v fueron las más permisivas de la cultura del folículo, y mantiene la más alta competencia en el desarrollo ^9. Hidrogeles de alginato no son degradables, por lo tanto un aumento en los resultados de folículos de diámetro en una fuerza de compresión en el folículo que pueden afectar el crecimiento del folículo ^10. Hemos desarrollado posteriormente un sistema de cultivo basado en una red de fibrina, alginato de interpenetración (FA-IPN), en el que se gelifican una mezcla de fibrina y alginato de forma simultánea. Esta combinación proporciona un entorno dinámico mecánico debido a que ambos componentes contribuyen a la rigidez de la matriz inicial, sin embargo, las proteasas secretado por el folículo creciente degradación de fibrina en la matriz de alginato dejando sólo para brindar apoyo. Con el IPN, el contenido de alginato se puede reducir por debajo del 0,25%, lo que no es posible con alginato solo ^5. Por lo tanto, cuando el folículo se expande, se experimentará una fuerza de compresión reducida debido a la reducida contenido de sólidos. En este documento, se describe un método de encapsulación y un sistema de cultivo in vitro de los folículos ováricos en un FA-IPN. El entorno mecánico dinámico simula el entorno del ovario natural en el que residen los pequeños folículos en la corteza rígida y pasar a una médula más permisiva, ya que aumentan de tamaño ^11. El componente degradable puede ser particularmente importante para la traducción clínica con el fin de apoyar el mayor de 10 ^{en 6} veces el aumento en el volumen que los folículos humanos normalmente pasan en vivo.

Protocolo

1. Folículo de aislamiento

Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices y normas establecidas por los Institutos Nacionales de la Salud Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y el uso establecido de Animales institucional y el protocolo de atención de la Northwestern University.

Para mejores resultados, todas las disecciones se llevan a cabo en los medios de comunicación L15 para controlar el pH en los niveles ambientales de CO _2, en 37 ° C se calienta etapas para el control de la temperatura, y sobre un banco limpio para reducir al mínimo la contaminación bacteriana. Los medios de disección (DM) se prepara con los medios de comunicación L15 suplementado con 50 UI / mL de penicilina y estreptomicina, 50 l / ml y 1% de SFB. El medio de mantenimiento (MM) se prepara con los medios de comunicación αMEM suplementado con 50 UI / mL de penicilina y estreptomicina 50 l / ml y 1% de SFB.

1. La transferencia de los ovarios recién disecados de 16 días de edad del ratón en un nuevo 35 mm placa de Petri con MM que contenía 0,1 ml 1-2 colagenasa% y 0,1% DNasa. Incubar durante 15 minutos dentro de una incubadora a 37 ° C y 5% CO _2.
2. Después de la incubación, realizar varias etapas de lavado en DM para eliminar la colagenasa, y luego transferir a una placa de Petri de 35 mm con MS nueva. Aislar a los folículos del ovario con cuidado parpadeo (o corte) de distancia de los folículos del ovario entero mediante el uso de dos de 28 5.8 agujas de calibre conectada a jeringas desechables. Eliminar la mayor estroma tanto como sea posible sin dañar la integridad del folículo. Diseccionar 20-40 folículos secundarios por ovario (130-150mm). Estos folículos suelen tener 2-3 capas de células somáticas.
3. Añadir 1 ml de MM a la central y de un mm de FIV 60 (fertilización in vitro) una placa de Petri, y 3 MM ml al anillo exterior. La transferencia de los folículos intactos con una pipeta para el anillo exterior de la placa de fertilización in vitro para aclarar brevemente, y luego selectivamente la transferencia en el pozo central (ver 1.4). Tienda de este plato de FIV en la incubadora.
4. Después de todos los folículos se recogen, la etapa de selección se realiza bajo un microscopio de disección con un aumento de 5 8x. Folículos sanos tiene las siguientes características morfológicas:
   • 2-3 capas de células somáticas
   • 130-150 mm
   • No hay separación entre el ovocito y las células somáticas
   • Ovocitos intactos y vuelta
     La transferencia de los folículos sanos en el centro de los platos de FIV para la encapsulación.

2. La encapsulación del folículo, Método 1 - "El método de la gota"

1. Añadir 1 ml de 50 UI / ml de trombina en TBS con 40 mM CaCl ₂ en el centro del plato y la FIV. Descongelar y mantener un balance de fibrinógeno (50 mg / ml en TBS) en el hielo. Llevar el fibrinógeno a temperatura ambiente justo antes de su uso.
2. Prepare la solución de fibrinógeno / alginato mediante la mezcla de PBS 1x, 0,5% de alginato en una solución de PBS y 50 mg / ml de solución de fibrinógeno en una proporción de 02:01:01 en un tubo de microcentrífuga de 1,7 ml estéril. Evitar la introducción de burbujas en la solución. Suavemente vortex y centrifugar. La solución parece un poco nublado y se debe preparar inmediatamente antes de su uso.
3. Coloque dos gotas de fibrinógeno / solución de alginato en el anillo exterior de un plato de fecundación in vitro: una gota de 90 l para el encapsulado y una gota de 10 l para el lavado. Para reducir la evaporación, apague la fase de calentamiento en el microscopio de disección. Transferencia de 10-15 folículos en la gota de 10 ml con una cantidad mínima de medios de cultivo (<5 l) con una punta de 200 micras micropipeta, y mezclar rápidamente. La transferencia de todos los folículos en la gota de 90 ml con una cantidad mínima de solución (<5 l) de la primera caída, y mezclar.
4. Al mismo tiempo aspirar a un folículo y 5 l de solución de fibrinógeno / alginato con una punta de pipeta de 10 l, y la liberación en la solución de trombina / Ca ^{2 +} en el plato de la FIV. Repita este paso hasta que todos los folículos están encapsulados.
5. Entrecruzar las cuentas durante 5-7 minutos en la solución de trombina / Ca ^{2 +.} Las cuentas se vuelven más oscuras, como geles de fibrina. Transferencia de las cuentas en una placa de Petri que contiene MM, a partir de las cuentas oscuras en primer lugar. Incubar la placa durante 15-30 minutos enla incubadora para enjuagar la trombina restante.
6. Transferencia de las cuentas en una placa de cultivo de 96 pocillos con 100 L de medio de crecimiento del folículo, y la imagen de inmediato. El medio de crecimiento (GM) se prepara con los medios de comunicación αMEM suplementado con 10 mUI / ml de FSH recombinante, 3 mg / ml de BSA, 1 mg / ml de bovino fetuin, 5 mg / ml de insulina, 5 mg / ml de transferrina, y 5 ng / ml de selenio.

3. La encapsulación del folículo, el método 2 - "El método de Parafilm"

1. Prepare la solución de fibrinógeno / alginato mediante la mezcla de solución al 0,5% de alginato y 50 mg / ml de solución de fibrinógeno en una proporción de 1:1 en un tubo de microcentrífuga de 1,7 ml estéril.
2. Pipeta de 7,5 l gotas de la mezcla de fibrinógeno / alginato en un portaobjetos de vidrio recubierto con parafina 3 espaciadores mm. La transferencia de un folículo en cada gota con un mínimosl cantidad de medios de comunicación.
3. Añadir 7,5 l de trombina / Ca ^{2 +} a la solución de cada caída. La mezcla es necesaria porque el gel de forma casi instantánea.
4. Cubrir el gel con la segunda placa de vidrio recubierta parafina, poner las diapositivas boca abajo en una placa de Petri de 100 mm, y la transferencia a la incubadora durante 5 minutos.
5. Transferencia de las cuentas en una placa de Petri que contiene MM, y luego en la cultura, así como se describió anteriormente. Si los granos se peguen, que se debe a enlaces cruzados entre las perlas, que pueden ser separados con cuidado con unas pinzas.

4. Folículo y el cambio de imagen los medios de comunicación

1. Cada dos días, los folículos se cultivan imágenes utilizando un microscopio de luz y el diámetro del folículo se mide con el programa de software ImageJ.
2. Cada dos días, la mitad de los medios de cultivo (50 l) se sustituye por medio fresco, el crecimiento de pre-equilibrio.

5. Folículo La recuperación de la Matrix 3D y en la maduración de ovocitos in vitro (IVM)

1. Después de 8 días de cultivo, los hidrogeles parece claro debido a la degradación total del componente de la fibrina, y ampliar los folículos con un diámetro de 300-400 micras. El resto de alginato se degrada por alginato-liasa, una enzima de origen vegetal que específicamente degrada el alginato y no afecta a las células animales.
2. Retire el medio de crecimiento de los pozos que contienen las cuentas y añadir 100 ml de 10 UI / mL en alginato liasa αMEM. Dejar la placa en la incubadora durante 25-30 minutos.
3. Eliminar los folículos de las perlas disueltas con una punta roma. Primera transferencia a la parte exterior de un plato de fecundación in vitro que contienen DM, y luego en el centro y, también contienen DM para lavar.
4. Después del lavado, la transferencia de los folículos a la exterior, y el anillo interno luego de un plato de fecundación in vitro que contienen medios de maduración. En los medios de maduración in vitro (IVM) se compone de αMEM, 10% de FCS, 1,5 UI / mL de hCG y 5 ng / mL del factor de crecimiento epidérmico (EGF)
5. Traslado a la incubadora de CO ₂ durante 15-16 horas.
   Examine los folículos de las células del cumulus expansión. Para eliminar las células del cúmulo de los ovocitos, agregar la solución de hialuronidasa a la concentración final de 0,1 mg / ml y se incuba en la incubadora durante 2-3 minutos. Utilice una punta de micropipeta de 75 mm para cortar las células del cúmulo de los ovocitos pipeteando arriba y abajo varias veces. Determinar la etapa de maduración del ovocito con una luz o un microscopio de disección. Las etapas posibles, de menos a más maduros, son los siguientes:
   • Degenerado. El ovocito se encuentra fragmentado en dos o más piezas.
   • Vesícula germinal (GV) el escenario. El ovocito no reanudar la meiosis en respuesta a la exposición de hCG, lo cual es evidente por la presencia continua del núcleo del ovocito (GV).
   • Ruptura de vesícula germinal (GVBD). La membrana nuclear está ausente de los ovocitos, pero no hay presencia de cuerpo polar. Por lo tanto, el ovocito se encuentra todavía en la meiosis-I.
   • Metafase II ovocitos detenidos (MII). El ovocito reanuda la meiosis, y ahora está detenido en la metafase II. Un cuerpo polar debe ser visible en una luz o un microscopio de disección. El ovocito se mantendrá en MII menos fertilizado en experimentos posteriores.

6. Los resultados representativos:

Se describe un nuevo método de encapsulación de los folículos ováricos en un FA-IPN para el cultivo in vitro (Figura 1). Folículos ováricos consiste en un oocito rodeado por varias capas de células somáticas. La comunicación entre los compartimentos celulares múltiples es esencial para el desarrollo de los folículos sanos y maduración de los ovocitos. Encapsulación folículo en un hidrogel 3D apoya la expansión del folículo, mientras que el mantenimiento de la arquitectura del folículo ^9,11,12. Como folículos se desarrollan, su volumen se expande de manera exponencial y la encapsulación de material biológico debe permitir esta expansión sin el desarrollo de una fuerza de compresión inhibición. FA-IPN es una red construida de dos materiales naturales, donde la fibrina por la plasmina degrada proteolíticamente activado por el folículo y el alginato es biológicamente inerte ¹³ (Figura 2). Durante el crecimiento del folículo, degradación de la fibrina se inicia a nivel local cerca del folículo, y continúa hasta que la fibrina se elimina del hidrogel. El componente alginato no degradables, que permanece intacto durante todo el período de la cultura, apoya la estructura 3D del hidrogel.

Folículos fueron aislados en la etapa secundaria de desarrollo (150-180 m de diámetro) y se amplió a 400 micras, con la etapa antral de desarrollo en los geles FA-IPN. Con el estímulo de hCG, los folículos cultivados puede experimentar expansión cúmulo de células, y los ovocitos se puede reanudar la meiosis y el progreso de la metafase II para la fertilización. Estos resultados sugieren que el método de encapsulación y el material de encapsulación permite la cultura y maduración folicular éxito in vitro (Figura 3).

Degradación de la fibrina en todo el Encapsulfolículos ated comienza el primer día de la cultura y se completa el día 6. La aprotinina, un inhibidor de plasmina soluble, se puede utilizar para alterar degradación de la fibrina y extender gradiente de mecánica en el material de encapsulación (Figura 4). Si los folículos son cultivadas con 0,01 TIU / ml aprotinina, la fibrina es más lenta degradación de los primeros 4 días. Sin embargo, los folículos aún puede desarrollarse en una etapa antral y los ovocitos son competentes para reanudar la meiosis de metafase II después de la aprotinina es la concentración removed.A alta de aprotinina (0,1 TIU / ml) inhibe significativamente la degradación de la fibrina, matriz de rigidez impide la expansión del folículo y de células somáticas invasión de la matriz que se observa.

Figura 1. Diagrama de flujo del desarrollo folicular. El folículo ovárico consiste en un ovocito situado en el centro rodeado por una o más capas de células somáticas, que apoyan el desarrollo de los ovocitos. Como los folículos se desarrollan de secundaria a la etapa antral preovulatorio, las células somáticas que rodean el ovocito proliferan y se diferencian, y el ovocito aumenta de tamaño. Maduración in vitro (IVM) es el paso final para el cultivo de folículos, cuando las células somáticas adyacente a la ovocito, llamado células del cumulus, ampliar después de la estimulación de hCG, y el ovocito reanuda la meiosis y progresa a una metafase II (MII) el escenario.

Figura 2a. Alginato y fibrina, alginato de cultivo de folículos 3D in vitro. (A) El alginato es un biomaterial naturales que es adecuado para el cultivo in vitro de folículos debido a su suave gelificación y características bioquímicas, como el tamaño de malla, la rigidez y la inercia biológica controlable. El alginato es un copolímero de polisacárido lineal de α-L-ácido gulurónico (G) y β-D-manurónico ácido (M). Las áreas con monómeros G repetir, denominado "G-bloques", se entrecruzan para formar un hidrogel en la presencia de iones de calcio divalente.

La figura 2b. (Bi) pequeños folículos encapsulado experiencia de baja fuerza de compresión en alginato en el inicio de la cultura. Sin embargo, cuando el folículo se expande el volumen desplazado en la cuenta va en aumento, lo que resulta en una mayor fuerza de compresión en la dirección opuesta a la expansión del folículo (B-II).

Figura 2c. Las cadenas de polímeros individuales son completamente enredados en la solución de alginato de fibrina antes de la reticulación. Ambos componentes de la FA-IPN comienzan a entrecruzar inmediatamente, ya que están expuestos a la mezcla de trombina y calcio.

Figura 3a. Diagrama de flujo para el aislamiento del folículo y la encapsulación de una FA-IPN. Folículos secundarios se aisló de un viejo ratón de 16 días (AI). Los órganos reproductivos son disecados (A-II), y los folículos aislados se transfirió a una placa con medio de mantenimiento (A-III).

Figura 3b El método de la gota para la encapsulación folículo en la solución de fibrinógeno alginato (B: I-IV).. Dos gotas de solución de fibrinógeno-alginato, la caída de lavado (10 l) y la caída de encapsulación (90 l) con pipeta en el plato (Bi). Próximos 3-5 folículos se transfieren a una caída de enjuague (B-II). Después de enjuagar y eliminar los medios de comunicación, los folículos se transfieren a la caída de encapsulación (B-III). Cada folículo se aspira con 5 l de fibrinógeno alginato solución con una pipeta 10 l, y luego expulsado en trombina / calcio solución (B-IV).

Figura 3c. El entrecruzamiento de cuentas durante 5 minutos. El método de parafina para la encapsulación folículo en la solución de fibrinógeno alginato (C: I-III). Fibrinógeno solución de alginato (7,5 l) es una pipeta en el portaobjetos de vidrio recubierto parafina y los folículos se transfieren individualmente a cada gota después del aclarado (Ci, ii). Solución de trombina (7,5 l) se agrega a cada gota (C-III).

Figura 3d - e. Las gotas son cubiertos con una lámina de vidrio recubierto segundo parafina y el FA-IPN se entrecruza en la incubadora durante 5 minutos. (D) Los folículos encapsulado se transfieren a un medio de cultivo en una placa de 96 pocillos. (E) Una imagen de un folículo encapsulado en el FA-IPN (flecha blanca).

Figura 4. Degradación de la fibrina por la creciente FolliCLE. Folículos degradar el componente de la fibrina de la FA-IPN durante el período de cultivo, lo cual es demostrado por un círculo blanco alrededor del folículo. Arquitectura 3D del folículo es apoyada por el resto de alginato. En el día 0 (D0) la fibrina está intacta y la matriz alrededor del folículo está nublado, después de un día en la cultura (D1) el anillo blanco alrededor del folículo aparece (flecha blanca) y el frente de degradación de la fibrina continúa su expansión radial en el día 2 (D2) y el día 4 (D4) de la cultura.

Figura 5. Imágenes de crecimiento del folículo. Representante de crecimiento del folículo imágenes ofsecondary en el FA-IPN en el día 0 (A), 4 (B), 6 (C) y 8 (D) de la cultura. Después de 8 días, los folículos antrales fueron madurados in vitro y los ovocitos MII resultante etapa se muestran (E, el cuerpo polar se muestra con la flecha de color negro).

Figura 6. Degradación de la fibrina fue inhibida por la aprotinina. Creciente folículos en el día 2, 4, 10 y 12 se muestran en la primera fila. Aprotinina en las concentraciones de 0,01 TIU / ml (segunda fila) y 0,1 TIU / ml se añadió a los medios de cultivo en los días 0, 2 y 4. Sólo folículo culturas con 0,01 TIU / ml aprotinina degradado la fibrina después de la eliminación de aprotinina y llegado a la etapa antral. Folículos cultivados en 0,1 TIU / ml aprotinina no creció en el FA-IPN.

Abreviación	Nombre y apellidos
Incubadora de CO 2	37 ° C incubadora con 5% de CO 2
COC	Cumulus complejo ovocito
3D	3 dimensiones
DM	Los medios de comunicación disección
FEAG	Factor de crecimiento epidérmico
FA-IPN	Fibrina, alginato de red interpenetrante
FBS	De suero fetal bovino
GM	Medios de cultivo
GV	Vesícula germinal
hCG	La gonadotropina coriónica humana
SU	La insulina de transferrina suplemento de selenio
FIV plato	Centro y 60 mm en una fuente de fertilización in vitro
MM	Medio de mantenimiento
MII ovocitos etapa	Ovocitos metafase II etapa
FSHr	Recombinante hormona estimulante folicular
TBS	Tris salina tamponada
TIU	Tripsina inhibidor unidades

Tabla 1. Abreviaturas

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Discusión

El folículo ovárico presenta un método de encapsulación en FA-IPN permite cultivo de folículos en un entorno 3D in vitro. A FA-IPN es un proceso dinámico, de células sensibles a la matriz en la que las propiedades mecánicas iniciales están determinadas por la combinación de ambos fibrina y alginato. Durante el cultivo, el folículo encapsulado activa proteasas que degradan el único componente de la IPN, la fibrina, que se traduce en una rigidez gel disminuyendo gradualmente que es aportado exclusivam...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fetuin	Sigma-Aldrich	F3385
FBS	Invitrogen	10082-139
Aprotinin	Roche Group	10236624001
CaCl2	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	039-00475	40 mM
EGF	Sigma-Aldrich	A412
rFSH	National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases
hCG	Sigma-Aldrich	CG-5
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	A1603
ITS	Sigma-Aldrich	I1884-1VL
L-15	GIBCO, by Life Technologies	11415
αMEM+Gluta MAX	GIBCO, by Life Technologies	32561
Pen-Strep	Cellgro	30-002-CI
TBS	Pierce, Thermo Scientific	28379
Tisseel Fibrin kit	Baxter Internationl Inc.	921030
Sodium Alginate	FMC BioPolymers	LF200DL	Mw 418kDa