タンパク質分解的に分解性3次元システムにおける卵胞のカプセル化と文化のための方法

要約

3Dフィブリン-アルギン酸相互貫入ネットワークにおける卵胞のカプセル化のための新しい方法が記載されている。このシステムは、成熟した卵母細胞を生成するために未熟な卵胞の発達をサポートするためにタンパク質分解と構造的な支持を兼ね備えています。このメソッドは、拡張を制限することなく、細胞間接触を維持するために培養細胞の集合体に適用してもよい。

要約

卵胞は、性ホルモンを分泌する卵巣の機能単位であり、卵母細胞の成熟を ​​サポートしています。 試験管内卵胞の技術では基本的な生物学を調査するためにモデルの卵胞発育にツールを提供し、さらにで妊孕性を温存する技術として開発されているクリニック^1-4。私たちの体外培養系では細胞間相互作用および傍分泌シグナリングその直接の卵胞発育^5、3D濾胞アーキテクチャを維持することによって、ネイティブの卵巣の環境を模倣するために、ヒドロゲルを採用しています。以前に、卵胞が正常にアルギン酸塩、カルシウムイオン^6月8日でゲル化を起こして不活性藻類由来の多糖類で培養した。 W / V 0.25％の濃度で形成されたアルギン酸ハイドロゲルは、卵胞の培養のための最も寛大であり、最も高い発生能^9を保持。アルギン酸ハイドロゲルは、このように、卵胞の成長^10を影響を与える可能性が卵胞に圧縮力で卵胞の直径の結果の増加分解性ではありません。私たちは、その後、フィブリンとアルギン酸の混合物を同時にゲル化されたフィブリンアルギン酸相互貫入ネットワーク（FA - IPN）、に基づいて、培養系を開発した。両方のコンポーネントが最初にマトリックスの剛性に寄与するので、この組み合わせは、動的な機械的な環境を提供しますが、成長する卵胞から分泌されるプロテアーゼは、サポートを提供する唯一のアルギン酸を残して行列にフィブリンを低下させる。 IPNと、アルギン酸の含有量は、アルギン酸⁵のみでは不可能である、0.25％未満に減少することができます。このように、卵胞が拡大するにつれて、それが減少固形分含有量のために少なく圧縮力が発生します。ここで、我々は、カプセル化方式とFA - IPN内の卵胞のためのin vitro培養系を説明します。動的な機械的な環境は、小さな卵胞が硬い皮質に存在し、彼らはサイズが¹¹に増加するとより寛大髄質に移動する自然卵巣の環境を模倣しています。分解可能な成分は、人間の毛包は、通常は生体内で受けることが体積で10以上^の6倍の増加をサポートするために、臨床翻訳のために特に重要になることがあります。

プロトコル

1。卵胞の分離

動物実験は、ノースウェスタン大学の実験動物と確立された動物実験を使用し、ケアのプロトコルの管理と使用に関する健康ガイドの国民の協会によって定められたガイドラインおよび規制に準拠して行った。

最適な結果を得るためには、すべての解剖は、細菌汚染を最小限に抑えるために37℃の温度制御のためのC加熱の段階、およびクリーンベンチで、CO ₂の環境レベルでのpH制御のためのL15メディアで実施されています。解剖のメディア（DM）が50 IU / mLのペニシリンおよび50mL /μLストレプトマイシン、1％FBSを添加したL15メディアで用意されています。保守メディア（MM）が50 IU / mLのペニシリンおよび50mL /μLストレプトマイシンおよび1％FBSを添加したαMEMメディアで用意されています。

1. 0.1％コラゲナーゼと0.1％DNaseを含む1 - 2mLとのMMと新しい35ミリメートルペトリ皿に16日齢のマウスから新鮮な解剖卵巣を転送します。 37℃、5％CO ₂インキュベーター内の15分間インキュベートする。
2. インキュベーション後、コラゲナーゼを除去し、新鮮なDMと35ミリメートルのシャーレに転送するためにDMで数回の洗浄ステップを実行します。 （またはカット）卵胞は、使い捨て注射器に接続された2つの28 5月8日ゲージの針を使用して全体の卵巣から軽くフリックで卵巣から卵胞を離れて分離する。卵胞の完全性を損​​なうことなく、できるだけ多くの間質​​を取り外します。卵巣あたり20〜40の二次卵胞（130〜150ミリメートル）をばらばらにする。これらの卵胞は、通常、体細胞の2-3層を持っている。
3. 60ミリメートルIVF（ 体外受精 ）をペトリ皿、および外輪に3mLのMMの中央のウェルに1 mLのMMを追加。簡単にリンスにIVFの皿の外側のリングに、ピペットで完全な毛包を転送し、選択的に（1.4を参照 ）中央のウェルに移す。インキュベーター内でこのIVF料理を保管してください。
4. すべての卵胞が収集された後、選択ステップは、5〜8倍の倍率と解剖顕微鏡下で行われる。健康な毛包には、次の形態的特徴を持っている。
   • 2〜3体細胞層
   • 130〜150ミリメートル
   • 卵母細胞と体細胞との間の分離の禁止
   • 無傷と丸い卵母細胞
     カプセル化のための体外受精皿の中心に健康な毛包を転送する。

2。卵胞のカプセル化、方法1 - "ドロップ方式"

1. 真ん中によくIVFディッシュの40mMのCaCl ₂を含むTBSで50 IU / mLのトロンビンの1 mLを追加します。氷上でフィブリノゲンの株式（TBSで50 mg / mL）を解凍してください。右使用前に室温にフィブリノゲンをもたらす。
2. 1 × PBS、PBS溶液、1.7 mLの滅菌マイクロ遠心チューブに午前2時01分01秒比で50 mg / mLのフィブリノーゲン溶液に0.5％アルギン酸を混合することによって、フィブリノーゲン/アルギン酸塩溶液を調製します。溶液中に気泡を導入することは避けてください。穏やかにボルテックスし、スピンダウン。解決策は、少し曇って表示され、使用直前に準備する必要があります。
3. 場所IVF皿の外側のリングのフィブリノーゲン/アルギン酸塩溶液2滴：カプセル化と洗浄のための10μL液滴の場合は90μL滴。蒸発を減らすために、解剖顕微鏡の加熱ステージをオフにしてください。 200μmのマイクロピペットチップを用いて培地の最小量（<5μL）と10μLの液滴に移転10月15日卵胞、かつ迅速に混合する。最小限の最初のドロップからの溶液の量（<5μL）、およびミックスと90μL液滴に卵胞のすべてを譲渡する。
4. 同時に1つの卵胞とIVF皿のトロンビン/ Ca ^{2 +の}溶液中に10μLピペットチップ、およびリリースを使用してフィブリノーゲン/アルギン酸塩溶液を5μLを吸引除去する。すべての卵胞がカプセル化されるまで、この手順を繰り返します。
5. クロスリンクトロンビン/ Ca ^{2 +の}溶液中で5〜7分間ビーズ。ビーズは、フィブリンゲルのような暗くなります。第一暗いビーズから始めて、ペトリ皿を含むMMにビーズを移す。 15〜30分、残りのトロンビンを洗い流しますするintheインキュベーターのための皿をインキュベートする。
6. すぐに100卵胞の成長媒体のμL、およびイメージを含む96ウェル培養プレートにビーズを移す。増殖培地は、（GM）組換えFSHの10 MIU / mLを補充したαMEMメディア、BSAの3 mg / mLに、ウシフェチュイン、インスリンの5μg/ mLの、トランスフェリン、5μg/ mLの、のに1 mg / mLで用意されてとセレンの5 ng / mLの。

3。卵胞のカプセル化、方法2 - "パラフィルム法"

1. 0.5％のアルギン酸塩溶液と1.7 mlの滅菌マイクロ遠心チューブに1:1の比率で50 mg / mLのフィブリノーゲン溶液を混合することによって、フィブリノーゲン/アルギン酸塩溶液を調製します。
2. 3 mmのスペーサーをパラフィルムでコーティングされたガラススライド上にフィブリノーゲン/アルギン酸混合物のピペット7.5μlの低下。極小値を持つ各ドロップに1包を転送するメディアのlの量。
3. 各ドロップにトロンビン/ Ca ^{2 +の}ソリューションの7.5μLを加える。ゲルは、ほぼ瞬時に形成されるため、混合が不要です。
4. 第二パラフィルムコーティングされたガラススライドでゲルをカバーして100mmのペトリ皿に逆さまにスライドを入れ、5分間インキュベーターに移す。
5. MMを含むペトリ皿にビーズを転送し、同様に前述の文化に。ビーズがくっつき場合、これはビーズの間に架橋することによるものである、彼らは静かに鉗子で区切ることができます。

4。卵胞のイメージングとメディア変更

1. 2日ごとに、培養卵胞は光学顕微鏡を用いて画像化され、卵胞の直径は、ソフトウェアプログラムのImageJで測定されます。
2. 2日毎に、増殖培地（50μL）の半分が新鮮、予め平衡化増殖培地に置き換えられます。

5。 3Dマトリックスからとin vitroでの卵成熟における卵胞の回復（IVM）

1. 文化の8日後、ハイドロゲルは、明確なフィブリン成分の劣化を完了するために表示され、卵胞は300から400ミクロンの直径に展開します。残りのアルギン酸はアルギン酸リアーゼ、特にアルギン酸を分解すると動物細胞には影響しない植物由来の酵素によって分解される。
2. ビーズを含むウェルから増殖培地を取り出して、αMEMで10 IU / mLのアルギン酸リアーゼの100 mLを加え。 25〜30分のためのインキュベーターでプレートにしておきます。
3. 平滑末端の先端との溶解ビーズから卵胞を削除します。 DMを含む体外受精の皿の外側のリングに最初の転送、およびその後も中心に、また、洗浄するためにDM含む。
4. 洗浄後、成熟培地を含有する体外受精の皿の内側、外側、そしてリングに卵胞を転送する。 体外成熟培地（IVM） では αMEM、10％FCS、hCGの1.5 IU / mLを、5 ng / mLのから構成されている上皮成長因子（EGF）の
5. 15〜16時間CO ₂インキュベーターに移す。
   卵丘細胞の拡大のための卵胞を調べます。卵母細胞から卵​​丘細胞を除去するには、2〜3分間インキュベーターの最終濃度は0.1 mg / mLとインキュベートするヒアルロニダーゼ溶液を加える。数回上下にピペッティングして卵母細胞からせん断卵丘細胞を75 mmのマイクロピペットチップを使用してください。光または解剖顕微鏡下で卵母細胞の成熟段階を決定する。可能なステージは、低いものから高い完成度に、以下のとおりです。
   • 退化。卵母細胞は、2つ以上の部分に分割されている場合。
   • 卵核胞（GV）のステージ。卵母細胞は卵母細胞の核（GV）の継続的な存在によって明らかである、hCGの暴露に応答して、減数分裂を再開しなかった。
   • 卵核胞崩壊（GVBD）。核膜は卵母細胞からの不在はありませんが、極体の存在はありません。そのため、卵母細胞が減数分裂- Iのままです。
   • 中期- IIは、卵母細胞（MII）を逮捕した。卵母細胞が減数分裂を再開し、現在、中期- IIで逮捕されている。極体は、光または解剖顕微鏡で見えるはずです。後の実験では受精しない限り、卵母細胞は、MIIのままになります。

6。代表的な結果：

我々は、in vitro培養のためのFA - IPNの卵胞の新たなカプセル化方式（図1）に記載。卵胞は、体細胞のいくつかの層に囲まれた卵母細胞で構成されています。複数の細胞内区画間の通信には、健全な卵胞発育と卵母細胞の成熟に必須である。卵胞^9,11,12のアーキテクチャを維持しながら、3Dハイドロゲルにおける卵胞のカプセル化は、卵胞の拡張をサポートしています。卵胞の開発として、そのボリュームは飛躍的に拡大し、カプセル化生体材料は、阻害圧縮力の発展なしにはこの拡張を許可する必要があります。 FA - IPNは、フィブリンが卵胞によって活性化とアルギン酸が（図^2）13生物学的に不活性であるプラスミンによって分解的に分解さ二つの自然の材料で構築されたネットワークです。卵胞の成長中に、フィブリン分解は、卵胞の近くに局所的に開始され、フィブリンがヒドロゲルからクリアされるまで継続します。培養期間を通して無傷のまま非分解性のアルギン酸塩成分は、、ハイドロゲルの三次元構造をサポートしています。

卵胞は、開発の第2段階（150〜180ミクロンの直径）で単離され、FA - IPNゲルの開発の胞状段階で400μmに拡大した。 hCGの刺激により、培養卵胞は、卵丘細胞の膨張を受けることができ、卵母細胞は受精のために中期IIに減数分裂と進行を再開することができます。これらの結果は、カプセル化方式および in vitro（図3） で卵胞の文化と成功成熟を ​​許可されたカプセル化材料ことを示唆している。

encapsul周りフィブリン分解ated卵胞は培養の最初の日に始まり、6日目までに完了する。アプロチニン、水溶性プラスミン阻害剤は、フィブリン分解を変更すると、封止材（図4）で機械的な勾配を拡張するために使用することができます。卵胞は、0.01 TIU / mlアプロチニンで培養されている場合、フィブリンは最初の4日間に分解速度が遅くなります。それにもかかわらず、卵胞はまだ胞状段階に開発することができますし、卵母細胞は、アプロチニン後中期IIに減数分裂を再開するために有能なままアプロチニンのremoved.A高濃度（0.1 TIU / mLのは）大幅にフィブリン分解を阻害され、マトリックスの剛性は、卵胞の拡張と体細胞を防止マトリックスへの侵入が観察される。

図1。卵胞発育のフローチャート。卵胞は、卵母細胞の発達をサポートする体細胞の1つまたは複数の層に囲まれた中心部に位置する卵母細胞で構成されています。卵胞が二次から排卵前胞状段階に発展として、卵母細胞を取り囲む体細胞は増殖と分化、そして卵母細胞のサイズが増加します。際に隣接する体細胞の体外成熟に （IVM）、卵胞の培養のための最終ステップです。卵母細胞は、卵丘細胞と呼ばれる、hCGの刺激の後に展開し、卵母細胞が減数分裂を再開し、中期II（MII）のステージに進む。

図2a。 in vitroでの 3D卵胞培養用アルギン酸とフィブリン-アルギン酸。（）アルギン酸は、in vitroでの卵胞のその穏やかなゲル化による文化やメッシュの大きさ、制御可能剛性と生物学的不活性などの生化学的特性、 に適している自然な生体材料です。アルギン酸は、α- L -グルロン酸（G）とβ- D -マンヌロン酸（M）の線形多糖類共重合体である。繰り返しGモノマーと地域は、"G -ブロック"と呼ばれる、二価のカルシウムイオンの存在下でハイドロゲルを形成するために架橋されています。

図2b。（BI）小型カプセル化された卵胞は、文化の先頭にアルギン酸の低圧縮力が発生します。しかし、卵胞がビーズの排水容積を拡大するにつれて卵胞の展開の逆方向（B - II）の大きな圧縮力、その結果、増加している。

図2c。個々のポリマーの鎖は、リンクを横断する前に、フィブリン-アルギン酸塩溶液中で完全にもつれている。 FA - IPNの両方のコンポーネントは、それらがトロンビンとカルシウムの混合物にさらされているとして、すぐに架橋するために始める。

図3a。 FA - IPN。二次卵胞の卵胞の分離およびカプセル化するためのフローチャートは、16日齢のマウス（愛）から分離されています。生殖器官は、（A - II）解剖され、そして分離された毛包は、保守メディア（A - III）を皿に移しています。

図3bフィブリノゲンのアルギン酸塩溶液（B：I - IV）の卵胞のカプセル化のためのドロップ方法。。フィブリノゲン-アルギン酸塩溶液2滴は、すすぎドロップ（10μL）とカプセル化のドロップ（90μL）をディッシュ（双方向）にピペットでされています。次の3-5包をすすぎドロップ（B - II）に転送されます。すすぎとメディアを除去した後、卵胞はカプセル化のドロップ（B - III）に転送されます。それぞれの卵胞は、10μLピペットチップで5μLフィブリノーゲン-アルギン酸塩溶液を吸引し、トロンビン/カルシウム溶液（B - IV）に排出されます。

図3c。5分間ビーズ架橋。フィブリノゲンのアルギン酸塩溶液中の卵胞のカプセル化のためのパラフィルム法（C：I - III）。フィブリノーゲン-アルギン酸塩溶液（7.5μL）はパラフィルムコーティングされたガラススライド上にピペットでと（CI、II）洗浄後に卵胞が各ドロップに個別に転送されます。トロンビン溶液（7.5μL）を各ドロップ（C - III）に追加されます。

図3d - E.滴第二パラフィルムコーティングスライドガラスで覆われているとFA - IPNは、5分間インキュベーターに架橋される。 （D）カプセル化された毛包は、96ウェルプレートでの成長のメディアに転送されます。 （E）FA - IPN（白矢印）でカプセル化された卵胞の画像。

図4。成長しているフォリフォリによるフィブリン分解CLE。卵胞が卵胞の周り明確な丸で示されている培養期間中にFA - IPNのフィブリン成分を低下させる。卵胞の3Dアーキテクチャは、残りのアルギン酸塩でサポートされています。 0日目（D0）フィブリンは無傷ですし、卵胞周囲マトリックスは曇りです。文化の中で1日（D1）の後に卵胞の周りをクリアリングが表示されます（白矢印）とフィブリン分解フロントは放射状の日に拡大を続けて培養液2（D2）と4日目（D4）。

図5。卵胞の成長の画像。0日目にFA - IPNの代表画像ofsecondary卵胞の成長（）、4（B）、6（C）と文化の8（D）。 8日後、胞状卵胞を体外で成熟し、得られたMIIの段階の卵母細胞は、（E、極体が黒い矢印で示される）表示されます。

図6。フィブリン分解はアプロチニンによって阻害された。2日目、4、10、12日に卵胞の成長は最初の行に示されている。アプロチニン濃度は0.01 TIU / mLの（2行目）と0.1 TIU / mLを日0,2、および4の培地に追加されました。わずか0.01 TIU / mlアプロチニンアプロチニン除去後の劣化したフィブリンと胞状段階に達したと文化が卵胞。 0.1 TIU / mlアプロチニンで培養した卵胞は、FA - IPNには成長しなかった。

略語	完全な名前
CO 2インキュベーター	37℃、5％CO 2とCのインキュベーター
COC	積雲卵母細胞複合体
3D	次元3
DM	解剖のメディア
EGF	上皮細胞成長因子
FA - IPN	フィブリンアルギン酸相互貫入ネットワーク
FBS	ウシ胎仔血清
GM	成長メディア
GV	卵核胞
hCGの	ヒト絨毛性ゴナドトロピン
ITSの	インスリントランスフェリンセレンのサプリメント
IVF料理	センター体外受精皿でも60ミリメートル
MM	保守メディア
MIIの段階の卵母細胞	中期IIステージ卵母細胞
rFSHの	組換え卵胞刺激ホルモン
TBS	トリス緩衝生理食塩水
TIU	トリプシン抑制ユニット

表1。略語

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ディスカッション

FA - IPNの提示卵胞のカプセル化手法は 、in vitro での 3D環境での卵胞培養することができます。 FA - IPNは、初期の機械的性質がフィブリンとアルギン酸塩の両方の組み合わせによって決定される動的な、細胞応答行列です。培養中に、カプセル化された卵胞はもっぱら文化の終わりに残っているアルギン酸塩により提供され徐々に減少するゲルの剛性につながるIPNの一成分のみ、...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fetuin	Sigma-Aldrich	F3385
FBS	Invitrogen	10082-139
Aprotinin	Roche Group	10236624001
CaCl2	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	039-00475	40 mM
EGF	Sigma-Aldrich	A412
rFSH	National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases
hCG	Sigma-Aldrich	CG-5
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	A1603
ITS	Sigma-Aldrich	I1884-1VL
L-15	GIBCO, by Life Technologies	11415
αMEM+Gluta MAX	GIBCO, by Life Technologies	32561
Pen-Strep	Cellgro	30-002-CI
TBS	Pierce, Thermo Scientific	28379
Tisseel Fibrin kit	Baxter Internationl Inc.	921030
Sodium Alginate	FMC BioPolymers	LF200DL	Mw 418kDa