Proteolitik Degradable 3 Boyutlu Sistem Yumurtalık Folikül Encapsulation ve Kültür Bir Yöntem

Özet

3D fibrin aljinat nüfuz ağ over folikül kapsülleme için yeni bir yöntem açıklanmıştır. Bu sistem, olgun oosit üretmek için olgunlaşmamış köklerinin gelişimini desteklemek için proteolitik degradasyon ile yapısal destek birleştirir. Bu yöntem, hücre-hücre genişleme sınırlayıcı olmadan kişileri korumak için kültürü hücre agrega uygulanan olabilir.

Özet

Seks hormonları salgılar yumurtalık fonksiyonel ünitesi over folikül ve oosit olgunlaşma destekleyen in vitro folikül teknikleri temel biyoloji araştırmak için model folikül gelişimi için bir araç sağlar ve fertiliteyi korumak için bir teknik olarak daha da geliştirilmektedir. kliniği ^1-4. Bizim in vitro kültür sistemi, hücre-hücre etkileşimleri ve parakrin sinyal, doğrudan folikül gelişimi ⁵ 3D foliküler mimarisini koruyarak doğal yumurtalık ortamı taklit etmek için hidrojeller kullanmaktadır. Daha önce, folikülleri başarıyla aljinat, kalsiyum iyonları ile jelleşme ^6-8 uğrar inert bir alg elde edilen polisakkarit kültüre edildi . 0.25% w / v bir konsantrasyon meydana Aljinatta hidrojeller folikül kültürü için en müsamahakar olduğunu ve en yüksek gelişim yeterlik ⁹ korudu. Aljinat hidrojeller böylece folikül gelişimi ¹⁰ etkisi folikül bir basınç kuvveti folikülün çapı sonuçları, parçalanabilir bir artış değildir. Biz daha sonra fibrin ve aljinat bir karışımını aynı anda jel olduğu bir fibrin aljinat nüfuz ağ (FA-IPN) dayalı bir kültür sistemi geliştirdi. Bu kombinasyon, her iki bileşen başlangıçta matris katılık katkıda bulunmak için, dinamik bir mekanik ortam sağlar, ancak artan folikül tarafından salgılanan proteazlar destek sağlamak için sadece aljinat bırakarak matris fibrin düşürür. NPI, aljinat içeriği% 0.25 'lik, tek başına ⁵ aljinat ile mümkün değildir altına düşebilir. Böylece, folikül genişledikçe, azaltılmış katı madde içeriği nedeniyle daha düşük bir basınç kuvveti yaşayacaksınız. Burada, bir kapsülleme yöntemi ve FA-IPN içinde yumurtalık folikülleri için bir in vitro kültür sistemi açıklanmaktadır. Dinamik mekanik ortamda küçük foliküller katı bir korteks ikamet eden ve bir daha müsamahakar medulla geçmek boyutu ¹¹ artış olduğu doğal yumurtalık ortamı taklit eder. Parçalanabilir bileşeni insan folikülleri normalde in vivo geçmesi hacim olarak daha büyük 10 ⁶ kat artış desteklemek amacıyla özellikle klinik çeviri için kritik olabilir.

Protokol

1. Folikül İzolasyon

Northwestern Üniversitesi kurallar ve düzenlemeler, Ulusal Sağlık Rehberi Enstitüleri tarafından belirlenen ve Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım için kurulan Kurumsal Hayvan Kullanımı ve Bakımı protokolü uyarınca hayvanlar üzerinde deneyler yapıldı.

Optimal sonuçlar için, tüm diseksiyonları bakteriyel kontaminasyonu en aza indirmek için 37 ° C sıcaklık kontrolü için ısıtmalı aşamaları ve temiz bir bankta, CO ₂ ortam düzeyde L15 medya pH kontrolü için yapılır. Diseksiyonu medya (DM), 50 IU / ml penisilin ve 50 ml / ml streptomisin ve% 1 FBS ile takviye L15 medya ile hazırlanmıştır. Bakım medya (AA) 50 IU / ml penisilin ve 50 ml / ml streptomisin ve% 1 FBS ile takviye αMEM medya ile hazırlanmıştır.

1. 16 günlük fare taze disseke yumurtalıklar,% 0.1 kollajenaz ve% 0.1 DNaz içeren 1-2 ml MM ile yeni bir 35 mm Petri kabı içine aktarın. 37 ° C ve% 5 CO ₂ bir inkübatör içinde 15 dakika boyunca inkübe edin.
2. Inkübasyondan sonra, kollajenaz çıkarın ve sonra taze DM 35 mm Petri kabında transfer DM birkaç yıkama adımları uygulayın. Yavaşça atılan şırınga bağlı iki 28 5 / 8 göstergesi iğneler kullanarak tüm yumurtalık (veya kesme) folikülleri uzak Flicking yumurtalık folikülleri izole edin. Folikülünün bütünlüğüne zarar vermeden, mümkün olduğu kadar çok stroma olarak çıkarın. Yumurtalık başına 20-40 ikincil foliküller (130-150mm) parçalara ayır. Bu foliküller genellikle 2-3 kat somatik hücre var.
3. 60 mm IVF (in vitro fertilizasyon) Petri kabı ve dış bilezik 3 mL MM merkezi için 1 ml MM ekleyin. Kısaca durulama IVF çanak dış halka bir pipet ile sağlam folikülleri aktarın ve sonra seçici (1.4 'e bakınız) merkezi bir kuyunun içine aktarabilirsiniz . Inkübatör bu IVF çanak saklayın.
4. Bütün kökler toplandıktan sonra, seçim adım 5-8x büyütme ile bir diseksiyon mikroskop altında yapılır. Sağlıklı folikülleri aşağıdaki morfolojik özellikleri:
   • 2-3 somatik hücre tabakaları
   • 130-150 mm
   • Oosit ve somatik hücre arasında hiçbir ayrım
   • Bozulmamış ve yuvarlak oosit
     Kapsülleme için tüp bebek yemekleri merkezi haline sağlıklı folikülleri aktarın.

2. Folikül Encapsulation, Yöntem 1 - "Bırak Yöntemi"

1. IVF çanak ortasına 40 mM CaCl ₂ ile 50 IU / ml trombin TBS içinde 1 ml ekleyin. Çözülme ve buz üzerinde fibrinojen stok tutmak (TBS 50 mg / ml). Fibrinojen hakkını kullanmak önce oda sıcaklığına kadar getirin.
2. Karıştırma 1x PBS,% 0.5 PBS çözüm aljinat ve 50 mg / ml fibrinojen çözüm 02:01:01 oranı 1.7 ml steril mikrosantrifüj tüp fibrinojen / aljinat çözeltisi hazırlayın. Çözüm kabarcıkları tanıtan kaçının. Yavaşça girdap ve spin-aşağı. Çözümü biraz bulanık görünür ve kullanmadan hemen önce hazırlanmalıdır.
3. Fibrinojen / Bir IVF çanağı dış halka aljinat çözüm iki damlacıkları: kapsülleme ve yıkama için 10 mcL damlacık için 90 mcL damlacık yerleştirin. Buharlaşma azaltmak için, ısıtma aşamasında diseksiyon mikroskobu kapatın. 200 mikron mikropipet ucu ve hızlı bir şekilde karıştırın kullanarak kültür ortamı (5 mcL) asgari bir miktarı ile 10 mcL damlacık içine transfer 10-15 folikülleri. Ilk damla çözüm en az bir miktarı (<5 mcL) ve karışımı ile 90 mcL damlacık tüm foliküllerin içine aktarın.
4. Aynı zamanda bir folikülü IVF çanak trombin / Ca ^{2 +} çözüm içine 10 mcL pipet, ve bırakın kullanarak fibrinojen / aljinat çözüm 5 mcL aspirat. Tüm foliküller kapsüllü kadar bu adımı tekrarlayın.
5. Cross-Link trombin / Ca ^{2 +} çözüm 5-7 dakika boncuk. Boncuk fibrin jel veya koyu hale gelecektir. Ilk koyu boncuklar ile başlayan, AA içeren bir Petri kabı içine boncuk aktarın. 15-30 dakika kalan trombin durulayın inthe inkübatör için çanak inkübe edin.
6. Hemen 100 folikül gelişimi medya mcL ve görüntü içeren 96 kuyu kültür plaka içine boncuk aktarın. Büyüme ortamı (GM) rekombinant FSH 10 mIU / mL, 3 mg / ml BSA ile desteklenmiş αMEM medya ile hazırlanan, 1 mg / mL sığır fetuin, 5 mg / ml insülin, 5 mg / ml transferrin, 5 ng / ml selenyum.

3. Folikül Encapsulation, Yöntem 2 - "Parafilm Yöntemi"

1. % 0.5 aljinat çözeltisi ve 50 mg / ml fibrinojen solüsyonu 1.7 ml steril mikrosantrifüj tüp 1:1 oranında karıştırılarak fibrinojen / aljinat çözüm hazırlayın.
2. 3 mm ayırıcılar ile parafilm kaplı cam slayt üzerine fibrinojen / aljinat karışımı Pipet 7.5 mcL damla. Bir minima her damla içine 1 folikül transferMedya l miktarı.
3. 7.5 mcL trombin / Ca ^{2 +} çözüm, her bir damla ekleyin. Jel oluşturması nedeniyle neredeyse anında Karıştırma gereksizdir.
4. Ikinci parafilm kaplı cam slayt jeller Kapak, 100 mm Petri kabı baş aşağı slaytları koyun, 5 dakika boyunca inkübatör transfer.
5. AA içeren bir Petri kabı içine boncuk aktarın ve kültürünün yanı sıra daha önce açıklanan içine. Boncuklar birbirine yapışırsa, boncuklar arasında çapraz bağlantı nedeniyle, hafifçe forseps ile ayrılmış olabilir.

4. Folikül Görüntüleme ve Medya değiştir

1. Her 2 günde bir, kültürlü foliküllerinin bir ışık mikroskobu ve folikülün çapı yazılım programı ImageJ ile ölçülür kullanarak görüntülü.
2. Her 2 günde bir, taze, ön-dengelenmiş büyüme medya tarafından, yarısı büyüme ortamı (50 mcL) değiştirilmiştir.

5. 3D Matrix ve in vitro Oosit Olgunlaşma Folikül Kurtarma (IVM )

1. Kültür 8 gün sonra, hidrojeller net bir fibrin bileşeni tamamlamak bozulması nedeniyle görünür ve köklerinin 300-400 mikron çapında genişletmek. Kalan aljinat aljinat liaz, özellikle aljinat düşürür ve hayvan hücreleri etkilemez bitki kaynaklı bir enzim tarafından parçalanır.
2. Boncuklar içeren kuyulardan büyüme ortamı çıkarın ve 10 IU / αMEM mL aljinat liaz 100 ml. Inkübatör plaka 25-30 dakika bırakın.
3. Künt bir son ucu ile çözünmüş boncuk folikülleri çıkarın. DM içeren bir IVF çanak dış halka ilk transferi ve daha sonra merkezi haline iyi yıkamak için DM içeren.
4. Yıkandıktan sonra, kıl foliküllerinin dış transferi, ve olgunlaşma medya içeren bir IVF çanak daha sonra iç bilezik, in vitro maturasyon medya (IVM) αMEM,% 10 FCS, hCG 1.5 IU / mL oluşur ve 5 ng / ml epidermal büyüme faktörü (EGF)
5. 15-16 saat CO ₂ inkübatör aktarın.
   Kümülüs hücreleri genişlemesi için folikülleri inceleyin. Oosit kümülüs hücreleri çıkarmak, nihai konsantrasyonu hiyalüronidaz çözüm eklemek 0,1 mg / ml ve 2-3 dakika inkübatörde inkübe. Birkaç kez aşağı yukarı pipetleme kesme oosit kümülüs hücreleri 75 mm mikropipet ucu kullanın. Bir ışık veya bir diseksiyon mikroskobu altında oosit olgunlaşma aşamasında belirleyin. Olası aşamaları, en en olgun,
   • Dejenere. Oosit, iki veya daha fazla parçalar halinde parçalanır.
   • Germinal vezikül (GV) evre. Oosit, oosit (GV) çekirdeğin varlığı ile devam açıktır hCG maruz yanıt mayoz devam etmedi.
   • Germinal vezikül dağılımı (GVBD). Nükleer membran oosit yoktur, ama kutup vücut mevcut yoktur. Bu nedenle, oosit mayoz-I halen devam etmektedir.
   • Metafaz-II tutuklandı oosit (MII). Oosit mayoz devam etti ve şimdi metafaz-II tutuklandı. Bir kutup vücudun bir ışık veya bir diseksiyon mikroskobu görünür olmalıdır. Daha sonraki deneylerde döllenmiş sürece oosit MII kalacaktır.

6. Temsilcisi Sonuçlar:

(Şekil 1) in vitro kültür için bir FA-IPN over foliküllerinin bir roman kapsülleme yöntemi tanımladı. Over foliküllerinin somatik hücre bazı katmanlar tarafından çevrili bir oosit oluşur. Birden fazla hücre bölmeleri arasındaki iletişim sağlıklı folikül gelişimi ve oosit olgunlaşması için gereklidir. Folikül ^9,11,12 mimarisi korurken 3D hidrojel Folikül kapsülleme folikül genişleme destekler. Folikül gelişmeye olduğu gibi, onların hacmi katlanarak genişler ve kapsülleme biyomateryal inhibe bir basınç kuvveti gelişimi olmadan bu genişleme izin vermelidir. FA-IPN fibrin plazmin tarafından folikül aktif ve aljinat (Şekil 2) ¹³ ve biyolojik olarak tesirsiz proteolitik parçalanabilir iki doğal malzemelerden yapılmış bir ağdır. Folikül gelişimi sırasında, fibrin yıkım folikül yakın yerel başlar ve fibrin hidrojel temizlenir kadar devam eder. Kültür dönemi boyunca bozulmadan kalır-bozunur olmayan aljinat bileşeni, hidrojel 3 boyutlu yapısını destekler.

Foliküllerin gelişme ikinci aşama (150-180 mikron çapında) izole ve FA-IPN jeller gelişme antral aşamada 400 mm genişletildi. HCG stimülasyon, kültürlü folikülleri, cumulus hücre genişleme geçmesi ve oositlerin döllenme için metafaz II mayoz ve ilerlemeye devam edebilirsiniz. Bu sonuçlar, kapsülleme yöntemini ve kapsülleme malzemesi in vitro (Şekil 3) follikül kültür ve başarılı bir olgunlaşma izin öneririz .

Encapsul etrafında fibrin yıkımated folikülleri kültürünün ilk günü başlar ve 6 günde tamamlanmıştır. Aprotinin, çözünen bir plazmin inhibitörü, fibrin yıkım değiştirmek ve kapsülleme malzemesi (Şekil 4) mekanik degrade uzatmak için kullanılabilir. Eğer foliküllerinin 0.01 TIU / ml aprotinin ile kültür, fibrin ilk 4 gün boyunca bozulmuş yavaş. Bununla birlikte, köklerinin hala antral aşamasına geliştirmek ve oosit aprotinin aprotinin removed.A yüksek konsantrasyonda (0.1 TIU / ml) sonra metafaz II mayoz devam etmek için yetkili kalır fibrin yıkım önemli ölçüde inhibe, matris sertlik folikül genişleme ve somatik hücre önler matriks içine işgali görülmektedir.

Şekil 1. Oosit gelişimini desteklemek somatik hücre bir veya daha fazla katman ile çevrili merkezi bir oositin folikül gelişimi Akış Şeması. Yumurtalık folikülü oluşur. Folikülleri preovulatory antral aşamada ikincil gelişir, oosit çevreleyen somatik hücre ne zaman somatik hücre bitişik, çoğalırlar ve farklılaştırmak ve oosit büyüklüğü artar. In vitro maturasyon (IVM) folikül kültürü için son adım oosit, kümülüs hücreleri olarak adlandırılan, hCG stimülasyon sonra genişletin ve oosit mayoz bölünme devam eder ve bir metafaz II (MII) evre ilerler.

Şekil 2a. In vitro 3D folikül kültür Aljinat ve fibrin-aljinat (a) Aljinatta nazik jelleşme ve biyokimyasal özellikleri, mesh boyutu, kontrol sertlik ve biyolojik inertlik nedeniyle in vitro folikül kültürü için uygun bir doğal biyomateryal. Aljinat α-L-guluronic asit (G) ve β-D-mannuronic asit (M) doğrusal bir polisakkarit kopolimer. Tekrar G monomerlerin Alanları, "G-blok" olarak adlandırdığı, kalsiyum, kalsiyum iyonlarının varlığında bir hidrojel oluşturmak için çapraz bağlanır.

Şekil 2b (iki) Küçük kapsüllü foliküllerinin kültürünün başında aljinat düşük basınç kuvveti deneyim. Ancak, folikül boncuk yerinden hacmi genişledikçe folikül genişleme ters yönde (b-ii) daha yüksek basınç kuvveti sonuçları artmaktadır.

Şekil 2c bireysel polimerlerin zincirleri çapraz bağlama önce fibrin aljinat çözüm tamamen dolaşmış. FA-IPN iki bileşenleri trombin ve kalsiyum karışımı maruz kalan hemen çapraz-bağlantı başlar.

Şekil 3a. FA-IPN İkincil folikülleri folikül izolasyon ve kapsülleme Akış Şeması 16 günlük fare (Ai) izole edilmiştir. Üreme organları (A-ii) disseke ve izole foliküllerinin bir tabak bakım medya (A-iii) ile aktarılır.

Şekil 3b fibrinojen aljinat çözüm folikül kapsülleme bırak yöntemi (B: i-iv). İki damla fibrinojen-aljinat çözümü, durulama, damla (10 mcL) ve kapsülleme damla (90 mcL) çanak (Bi) pipetlenir. Sonraki 3-5 foliküllerinin bir durulama damla (B-ii) transfer edilir. Durulama ve medya kaldırma sonra, folikülleri kapsülleme açılan (B-iii) aktarılır. Her bir follikül 10 mcL pipet ucu ile 5 mcL fibrinojen-aljinat çözüm emişli ve sonra trombin / kalsiyum solüsyonu (B-iv) içine atılır.

Şekil 3c 5 dakika boncuk çapraz bağları. Parafilm fibrinojen aljinat çözüm folikül kapsülleme yöntemi (C: i-iii). Fibrinojen-aljinat çözeltisi (7.5 mcL) parafilm kaplı cam slayt pipetlenebilir ve (Ci, ii) durulandıktan sonra folikülleri ayrı ayrı her bir damla aktarılır. Trombin solüsyonu (7.5 mcL), (C-iii) her damla eklenir.

Şekil 3d e. damla ikinci bir parafilm kaplı cam slayt ile kaplıdır ve FA-IPN 5 dakika inkübatör çapraz. (D) 96-plaka kapsüllü foliküllerinin büyüme ortama aktarılır. (E) FA-IPN (beyaz ok) bir kapsüllü folikül bir görüntü.

Şekil 4. Büyüyen folli fibrin yıkımcle. Foliküllerin folikülü etrafında açık bir daire ile gösterilmiştir kültür dönemi boyunca, FA-IPN fibrin bileşeni bozulmasına yol açar. Folikül 3D mimarisi kalan aljinat tarafından desteklenmektedir. 0 (D0) fibrin hala bozulmamış ve folikülün etrafında matris bulutlu; kültür 1 gün folikülün etrafında açık halka görünür (D1) (beyaz ok) ve fibrin yıkım ön radyal gün genişletmeye devam ediyor sonra günü 2 (D2) ve kültür gün 4 (D4).

Şekil 5. Folikül gelişimi Görüntüler gün 0 FA-IPN Temsilcisi görüntüleri ofsecondary folikül gelişimi (A), 4 (B), 6 (C) ve 8 (D) kültür. 8 gün sonra, antral foliküller in vitro olgunlaştı ve MII aşamada oosit (E, kutup vücut siyah ok ile gösterilen) gösterilmiştir.

Şekil 6. Fibrin yıkım aprotinin inhibe olmuştur. Gün 2, 4, 10 ve 12 folikülleri büyüyen ilk satırda gösterilmiştir. Aprotinin konsantrasyonlarda 0.01 TIU / ml (ikinci satır) ve 0.1 TIU / ml kültür ortamı, 0, 2 ve 4 gün eklendi. Sadece aprotinin kaldırma sonra 0.01 TIU / ml aprotinin bozulmuş fibrin kültürler folikül ve antral aşamasına gelinmiştir. 0.1 kültür foliküllerin TIU / ml aprotinin FA-IPN büyümeye vermedi.

Kısaltma	Tam adı
CO 2 inkübatör	% 5 CO 2 ile 37 ° C inkübatör
COC	Cumulus oosit kompleksi
3D	Boyutlu 3
DM	Diseksiyon medya
AGF	Epidermal büyüme faktörü
FA-IPN	Fibrin-aljinat nüfuz ağ
FBS	Fetal sığır serumu
GM	Büyüme medya
GV	Germinal vezikül
hCG	İnsan koryonik gonadotropin
ITS	İnsülin Transferrin selenyum takviyesi
IVF çanak	Iyi Center, in vitro fertilizasyon çanak 60 mm
AA	Bakım medya
MII aşamada oosit	Metafaz II aşamada oosit
rFSH	Rekombinant Folliküler Uyarıcı Hormon
TBS	Tris tamponlu salin
TIU	Tripsin inhibitör birimler

Tablo 1 Kısaltmalar

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

FA-IPN sunulan over folikül kapsülleme yöntemi, in vitro 3D ortamda folikül kültür sağlar . FA-IPN ilk mekanik özellikleri hem fibrin ve aljinat kombinasyonu tarafından belirlendiği bir dinamik, duyarlı hücre-matriks. Kültür sırasında, kapsüllü folikül sadece kültür sonunda kalan aljinat katkıda yavaş yavaş azalan bir jel sertlik sonuçları IPN sadece bir bileşeni, fibrin, aşağılamak proteazlar aktive eder. FA-IPN ile elde edilen dinamik mekanik özellikleri, gelişmekte olan kökle...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fetuin	Sigma-Aldrich	F3385
FBS	Invitrogen	10082-139
Aprotinin	Roche Group	10236624001
CaCl2	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	039-00475	40 mM
EGF	Sigma-Aldrich	A412
rFSH	National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases
hCG	Sigma-Aldrich	CG-5
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	A1603
ITS	Sigma-Aldrich	I1884-1VL
L-15	GIBCO, by Life Technologies	11415
αMEM+Gluta MAX	GIBCO, by Life Technologies	32561
Pen-Strep	Cellgro	30-002-CI
TBS	Pierce, Thermo Scientific	28379
Tisseel Fibrin kit	Baxter Internationl Inc.	921030
Sodium Alginate	FMC BioPolymers	LF200DL	Mw 418kDa