Un metodo per l'incapsulamento follicolo ovarico e la cultura in un proteoliticamente degradabile 3 Sistema dimensionale

Riepilogo

Un nuovo metodo per l'incapsulamento follicolo ovarico in una rete di fibrina-alginato 3D compenetrano è descritto. Questo sistema combina un sostegno strutturale con degradazione proteolitica per sostenere lo sviluppo dei follicoli immaturi per la produzione di ovociti maturi. Questo metodo può essere applicato agli aggregati di coltura cellulare per mantenere la cellula-cellula contatti senza limitare l'espansione.

Abstract

Il follicolo ovarico è l'unità funzionale dell'ovaio che secerne ormoni sessuali e supporta la maturazione degli ovociti. Follicolo Nelle tecniche in vitro fornire uno strumento per lo sviluppo del modello follicolo per studiare biologia di base, e sono ulteriormente sviluppata come una tecnica per preservare la fertilità del clinica ^1-4. Il nostro sistema di coltura in vitro impiega idrogel in modo da simulare l'ambiente nativo ovarico, mantenendo l'architettura 3D follicolare, interazioni cellula-cellula e di segnalazione paracrina che lo sviluppo del follicolo diretta ^5. In precedenza, i follicoli sono stati colti con successo in alginato, un inerte alghe polisaccaride derivato che subisce gelificazione con gli ioni calcio ^6-8. Idrogel alginato formata ad una concentrazione di 0,25% w / v sono stati i più permissivi per la cultura follicolo, e mantenuto la massima competenza dello sviluppo ^9. Idrogel alginato non sono degradabili e quindi un aumento del diametro del follicolo risultati in una forza di compressione sul follicolo che possono influenzare la crescita del follicolo ^10. Successivamente abbiamo sviluppato un sistema di coltura basato su una rete di fibrina-alginato compenetrano (FA-IPN), in cui sono gelificato una miscela di fibrina e alginato contemporaneamente. Questa combinazione offre un ambiente dinamico meccanico perché entrambi i componenti contribuiscono alla rigidità matrice inizialmente, tuttavia, proteasi secreto dal follicolo crescente degrado fibrina nella matrice di alginato lasciando solo quello di fornire supporto. Con l'IPN, il contenuto alginato può essere ridotto al di sotto dello 0,25%, il che non è possibile con alginato solo ^5. Così, come il follicolo si espande, si sperimenterà una forza di compressione ridotto a causa del ridotto contenuto di solidi. Qui, descriviamo un metodo di incapsulamento e di un sistema di coltura in vitro di follicoli ovarici in una FA-IPN. L'ambiente dinamico meccanico imita l'ambiente naturale in cui follicoli ovarici piccolo risiedono in una corteccia rigido e passare a un midollo più permissiva in quanto aumentano di dimensione ^11. La componente degradabile può essere particolarmente critico per la traduzione clinica al fine di supportare il maggiore di 10 aumento di ⁶ volte il volume che i follicoli umani normalmente sottoposti in vivo.

Protocollo

1. Follicolo di isolamento

Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida e regolamenti stabiliti dal National Institutes of Health Guide per la cura e l'uso di animali da laboratorio e l'uso degli animali istituito istituzionali e protocollo di cura presso la Northwestern University.

Per risultati ottimali, tutti dissezioni sono svolte in L15 mezzi per il controllo del pH a livelli ambientali di CO _2, a 37 ° C fasi riscaldato per il controllo della temperatura, e su una panchina pulita per minimizzare la contaminazione batterica. I media dissezione (DM) è preparata con i media L15 integrata con 50 UI / ml penicillina e 50 microlitri / ml streptomicina e 1% FBS. I mezzi di manutenzione (MM) è preparata con i media αMEM integrata con 50 UI / ml penicillina e 50 microlitri / ml streptomicina e 1% FBS.

1. Trasferimento ovaie appena sezionato da 16 giorni vecchio mouse in un piatto nuovo 35 millimetri Petri con 1-2 MM Collagenasi mL contenente 0,1% e 0,1% DNasi. Incubare per 15 minuti all'interno di un incubatore a 37 ° C e 5% di CO _2.
2. Dopo l'incubazione, eseguire diverse fasi di lavaggio in DM per rimuovere collagenasi, e poi il trasferimento ad un piatto 35 millimetri Petri con DM fresca. Isolare follicoli dall'ovaio delicatamente sfogliando (o il taglio), follicoli di distanza dal ovaio intero utilizzando due aghi calibro 28 08/05 allegata al siringhe monouso. Rimuovere il stroma più possibile, senza danneggiare l'integrità del follicolo. Sezionare i 20-40 follicoli secondari per dell'ovaio (130-150mm). Questi follicoli di solito hanno 2-3 strati di cellule somatiche.
3. Aggiungere 1 ml di MM al pozzo centrale di mm FIV 60 (fecondazione in vitro) piastra di Petri, e 3 MM mL per l'anello esterno. Trasferimento follicoli intatti con una pipetta per l'anello esterno del piatto FIV per sciacquare brevemente, e poi selettivamente trasferirli nel pozzo centrale (vedi 1.4). Conservare questo piatto FIV nell'incubatrice.
4. Dopo che tutti i follicoli sono raccolti, la fase di selezione viene effettuata con un microscopio da dissezione con un 5-ingrandimento 8x. Follicoli sani hanno le seguenti caratteristiche morfologiche:
   • 2-3 strati di cellule somatiche
   • 130-150 millimetri
   • Nessuna separazione tra ovocita e cellule somatiche
   • Ovociti intatto e rotondo
     Trasferire i follicoli sani al centro di piatti FIV per l'incapsulamento.

2. Follicolo incapsulamento, Metodo 1 - "Il metodo Drop"

1. Aggiungere 1 ml di 50 UI / ml di trombina in TBS con 40 mM CaCl ₂ in mezzo e del piatto FIV. Scongelare e mantenere magazzino fibrinogeno (50 mg / mL in TBS) sul ghiaccio. Portare il fibrinogeno a temperatura ambiente a destra prima dell'uso.
2. Preparare il fibrinogeno / alginato soluzione mescolando 1x PBS, 0,5% di alginato in soluzione PBS e 50 mg / mL di soluzione di fibrinogeno nel rapporto 02:01:01 in un tubo da microcentrifuga 1,7 ml sterili. Evitare di introdurre bollicine nella soluzione. Delicatamente vortice e spin-down. La soluzione appare leggermente torbida e deve essere preparata immediatamente prima dell'uso.
3. Inserire due gocce di fibrinogeno / soluzione alginato nell'anello esterno di un piatto FIV: un 90 gocce microlitri per l'incapsulamento e 10 gocce microlitri per il lavaggio. Per diminuire l'evaporazione, spegnere la fase di riscaldamento sul microscopio da dissezione. Trasferimento 10-15 follicoli in gocce 10 L con una minima quantità di terreni di coltura (<5 mL) con un punta micropipetta 200 micron, e mescolare rapidamente. Trasferire tutti i follicoli in gocce 90 microlitri con una minima quantità di soluzione (<5 mL) dalla prima goccia, e mescolare.
4. Contemporaneamente aspirare un follicolo e 5 ml di fibrinogeno / alginato soluzione con un punta di 10 microlitri pipetta, e rilascio nel trombina / soluzione di Ca ^{2 +} nel piatto FIV. Ripetere questa operazione finché tutti i follicoli sono incapsulati.
5. Cross-link le perline per 5-7 minuti in trombina / soluzione di Ca ^{2 +.} Le perle diventerà più scuro come gel di fibrina. Trasferire le perle in una capsula di Petri contenente MM, a partire dai grani più scura per primo. Incubare il piatto per 15-30 minuti InThe incubatore per sciacquare la trombina rimanenti.
6. Trasferire le perle in una piastra a 96 cultura e contenente 100 ml di mezzi di crescita del follicolo, e di immagine subito. I media di crescita (GM) si prepara con i media αMEM integrata con 10 mUI / ml di FSH ricombinante, 3 mg / mL di BSA, 1 mg / ml di bovini Fetuina, 5 mg / ml di insulina, 5 mg / ml di transferrina, e 5 ng / ml di selenio.

3. Follicolo incapsulamento, Metodo 2 - "Il metodo Parafilm"

1. Preparare il fibrinogeno / alginato soluzione miscelando una soluzione di alginato 0,5% e 50 mg / mL di soluzione di fibrinogeno in un rapporto di 1:1 in una provetta da microcentrifuga 1,7 ml sterili.
2. Pipettare 7,5 ml di gocce del fibrinogeno / alginato miscela su un vetrino rivestito parafilm con distanziali da 3 mm. Trasferire 1 follicolo in ogni goccia con minimiquantità l di media.
3. Aggiungere 7,5 ml di trombina / Ca ^{2 +} soluzione ad ogni goccia. La miscelazione è inutile perché il gel forme quasi istantaneamente.
4. Coprire il gel con il secondo vetrino parafilm rivestito, mettere le diapositive a testa in giù in una capsula di Petri 100 mm, e trasferimento in incubatore per 5 minuti.
5. Trasferire le perle in una capsula di Petri contenente MM, e poi nella cultura così come descritto in precedenza. Se i talloni stare insieme, che è causa di cross-linking tra le perle, possono essere separati delicatamente con una pinza.

4. Follicolo Imaging e cambiamento media

1. Ogni 2 giorni, i follicoli colta sono esposte utilizzando un microscopio ottico e il diametro follicolare viene misurata con il software di programma ImageJ.
2. Ogni 2 giorni, la metà dei terreni di crescita (50 mL) è sostituito dal fresco, pre-equilibrato dei media di crescita.

5. Recupero follicolo da Matrix 3D e in maturazione in vitro degli ovociti (IVM)

1. Dopo 8 giorni di coltura, la idrogel appare chiaro a causa della completa degradazione della componente fibrina, ed i follicoli espandersi ad un diametro di 300-400 micron. L'alginato rimanente viene degradata da alginato-liasi, un impianto di derivazione enzima che degrada specificamente alginato e non influisce sulle cellule animali.
2. Rimuovere i supporti di crescita da pozzetti contenenti le perline e aggiungere 100 mL di 10 UI / ml in alginato liasi αMEM. Lascia la piastra nell'incubatore per 25-30 minuti.
3. Rimuovere follicoli dalla perline sciolto con una punta fine smussata. Primo trasferimento per l'anello esterno di un piatto contenente FIV DM, e poi verso il centro e, anche contenenti DM da lavare.
4. Dopo il lavaggio, trasferire i follicoli per l'esterno, e poi l'anello interno di un piatto FIV contenente i media stagionatura. In mezzi maturazione in vitro (IVM) è composto da αMEM, 10% FCS, 1,5 UI / ml di hCG, e di 5 ng / mL del fattore di crescita epidermico (EGF)
5. Trasferimento a CO ₂ incubatore per 15-16 ore.
   Esaminare i follicoli per l'espansione delle cellule cumuliformi. Per rimuovere le cellule del cumulo dal ovocita, aggiungere ialuronidasi soluzione a una concentrazione finale 0,1 mg / ml ed incubare nell'incubatore per 2-3 minuti. Utilizzare una punta di 75 mm a taglio micropipetta cellule del cumulo dal ovocita pipettando su e giù parecchie volte. Determinare fase di maturazione dell'ovocita sotto una luce o di un microscopio da dissezione. Le tappe possibili, dal meno al più maturi, sono i seguenti:
   • Degenerata. L'ovocita è frammentato in due o più pezzi.
   • Vescicola germinale (GV) stadio. L'ovocita non ha ripreso la meiosi in risposta all'esposizione hCG, che è evidente dalla presenza continua del nucleo dell'ovocita (GV).
   • Vescicola germinale ripartizione (GVBD). La membrana nucleare è assente l'ovocita, ma non è presente corpo polare. Pertanto, l'ovocita è ancora in meiosi-I.
   • Metafase II ovocita arrestato (MII). L'ovocita ripreso la meiosi, ed è ora arrestato in metafase II. Un corpo polare deve essere visibile su una luce o un microscopio da dissezione. L'ovocita MII rimarrà a meno che non fecondate in esperimenti successivi.

6. Rappresentante dei risultati:

Abbiamo descritto un nuovo metodo di incapsulamento dei follicoli ovarici in una FA-IPN per la coltura in vitro (Figura 1). Follicoli ovarici costituito da un ovocita circondato da diversi strati di cellule somatiche. La comunicazione tra i comparti multipli cellulare è essenziale per lo sviluppo dei follicoli sani e la maturazione degli ovociti. Incapsulamento follicolo in un idrogel 3D supporta l'espansione follicolo, pur mantenendo l'architettura del follicolo ^9,11,12. Come sviluppare follicoli, il loro volume aumenta in modo esponenziale e il incapsulamento biomateriale dovrebbe consentire questa espansione senza lo sviluppo di una forza inibire compressione. FA-IPN è una rete integrata di due materiali naturali, in cui la fibrina è proteoliticamente degradabile da plasmina attivata dal follicolo e alginato è biologicamente inerte ¹³ (Figura 2). Durante la crescita del follicolo, degradazione della fibrina inizia a livello locale nei pressi del follicolo, e continua fino a quando la fibrina viene cancellata dal idrogel. La componente non degradabile alginato, che rimane intatta per tutto il periodo della cultura, sostiene la struttura 3D del idrogel.

Follicoli sono stati isolati nella fase secondaria di sviluppo (150-180 micron di diametro) e ampliato a 400 micron in fase antrale di sviluppo nel FA-IPN gel. Con la stimolazione con hCG, i follicoli colto può subire l'espansione delle cellule cumulo, e ovociti può riprendere la meiosi e il progresso di metafase II per la fecondazione. Questi risultati suggeriscono che il metodo di incapsulamento e il materiale incapsulante permesso cultura follicolo e la maturazione in vitro di successo (Figura 3).

Degradazione della fibrina attorno al encapsulfollicoli ated inizia il primo giorno di cultura, ed è completata da giorno 6. Aprotinina, un inibitore della plasmina solubili, possono essere utilizzati per alterare degradazione della fibrina e di estendere gradiente meccaniche nel materiale incapsulante (Figura 4). Se follicoli sono coltivati ​​con 0,01 TIU / ml aprotinina, la fibrina è più lento degrado per i primi 4 giorni. Tuttavia, i follicoli può ancora sviluppare allo stadio antrale e ovociti restano competenti per riprendere la meiosi di metafase II, dopo l'aprotinina è removed.A alta concentrazione di aprotinina (0,1 TIU / mL) inibisce in maniera significativa degradazione della fibrina, matrice di rigidezza impedisce l'espansione del follicolo e delle cellule somatiche invasione nella matrice si osserva.

Figura 1. Diagramma di flusso di sviluppo del follicolo. Il follicolo ovarico è costituito da un ovocita in posizione centrale circondato da uno o più strati di cellule somatiche, che sostengono lo sviluppo degli ovociti. Come sviluppare follicoli dalla secondaria alla fase preovulatoria antrale, le cellule somatiche che circonda l'ovocita proliferare e differenziarsi, e l'ovocita aumenta di dimensioni. Maturazione in vitro (IVM) è il passo finale per la cultura follicolo, quando le cellule somatiche adiacenti alla ovocita, chiamate cellule del cumulo, espandere dopo stimolazione con hCG, e l'ovocita riprende la meiosi e progredisce ad un metafase II (MII) stadio.

Figura 2a. Alginato e fibrina-alginato per la cultura follicolo 3D in vitro. (A) alginato è un biomateriale naturale che è adatto per la cultura follicolo in vitro grazie alla sua gelificazione dolce e caratteristiche biochimiche, come la dimensione delle maglie, rigidità controllabile e inerzia biologica. Alginato è un copolimero polisaccaride lineare di α-L-guluronic acido (G) e β-D-mannuronico acido (M). Le aree con monomeri G ripetere, denominato "G-blocchi", sono interconnessi per formare un idrogel, in presenza di ioni calcio bivalenti.

Figura 2b. (Bi) Piccoli follicoli incapsulato esperienza bassa forza di compressione in alginato all'inizio della cultura. Tuttavia, poiché il follicolo si espande il volume spostato nel tallone è in aumento, che si traduce in una maggiore forza di compressione nella direzione opposta di espansione follicolo (b-ii).

Figura 2c. Le catene di polimeri individuali sono completamente impigliata nella fibrina-alginato soluzione prima del cross-linking. Entrambi i componenti della FA-IPN iniziare a cross-link immediatamente in quanto sono esposti alla miscela di trombina e calcio.

Figura 3a. Diagramma di flusso per l'isolamento del follicolo e l'incapsulamento in un FA-IPN. Follicoli secondari sono isolati da 16 giorni di vecchio mouse (Ai). Gli organi riproduttivi sono sezionato (A-II), e follicoli isolati sono trasferito in un piatto con i media manutenzione (A-III).

Figura 3b Il metodo goccia per l'incapsulamento follicolo in soluzione fibrinogeno alginato (B: I-IV).. Due gocce di fibrinogeno-alginato soluzione, la caduta di risciacquo (10 mL) e la caduta di incapsulamento (90 mL) sono pipettati nel piatto (Bi). Prossimi 3-5 follicoli vengono trasferiti in una goccia di risciacquo (B-II). Dopo il risciacquo e la rimozione dei media, i follicoli sono trasferiti al calo incapsulamento (B-III). Ogni follicolo è aspirato con 5 microlitri fibrinogeno-alginato soluzione con una punta di 10 microlitri pipetta e poi espulso in trombina / calcio soluzione (B-iv).

Figura 3 quater. Il reticola tallone per 5 minuti. Il metodo di parafilm per l'incapsulamento follicolo in soluzione fibrinogeno alginato (C: I-III). Fibrinogeno-alginato di soluzione (7,5 mL) è pipettati sul vetrino rivestito parafilm e follicoli vengono trasferiti individualmente ad ogni goccia dopo il risciacquo (Ci, ii). Trombina soluzione (7,5 mL) viene aggiunto a ogni goccia (C-III).

Figura 3d - e. Le gocce sono coperti con un secondo vetrino parafilm rivestiti e la FA-IPN è reticolato in incubatrice per 5 minuti. (D) I follicoli incapsulati vengono trasferiti ai media la crescita in una piastra da 96 pozzetti. (E) L'immagine di un follicolo incapsulato nel FA-IPN (freccia bianca).

Figura 4. Degradazione della fibrina dalla crescente FolliCLE. Follicoli degradare la fibrina componente della FA-IPN durante il periodo di cultura, che è dimostrato da un cerchio chiaro intorno al follicolo. Architettura 3D del follicolo è supportata dal alginato rimanenti. Il giorno 0 (D0) la fibrina è ancora intatta e la matrice di tutto il follicolo è nuvoloso; dopo 1 giorno in coltura (D1), l'anello libero intorno al follicolo appare (freccia bianca) e la parte anteriore di degradazione della fibrina continua ad espandersi radialmente il giorno 2 (D2) e il giorno 4 (D4) della cultura.

Figura 5. Immagini di crescita del follicolo. Rappresentante la crescita del follicolo immagini ofsecondary nella FA-IPN il giorno 0 (A), 4 (B), 6 (C) e 8 (D) della cultura. Dopo 8 giorni, i follicoli antrali sono stati maturati in vitro, e la conseguente fase di ovociti MII sono mostrati (E, il corpo polare viene mostrata con freccia nera).

Figura 6. Fibrina degradazione è stata inibita da aprotinina. Crescente follicoli il giorno 2, 4, 10 e 12 sono riportati nella prima riga. Aprotinina a concentrazioni 0,01 TIU / mL (seconda fila) e 0,1 TIU / mL è stato aggiunto al terreno di coltura nei giorni 0, 2 e 4. Solo follicolo culture con 0,01 TIU / ml aprotinina degradato la fibrina dopo la rimozione aprotinina ed ha raggiunto fase antrale. Follicoli colto in 0,1 TIU / ml aprotinina non è cresciuto nella FA-IPN.

Abbreviazione	Nome e cognome
CO 2 incubatore	37 ° C incubatore al 5% di CO 2
COC	Complessi cumulo oocita
3D	Dimensionale 3
DM	Dissezione dei media
FEG	Fattore di crescita epidermico
FA-IPN	Fibrina-alginato rete compenetrano
FBS	Siero bovino fetale
GM	La crescita dei media
GV	Vescicola germinale
hCG	Gonadotropina corionica umana
ITS	Transferrina supplemento di insulina Selenio
FIV piatto	Centro ben 60 mm di piatto fecondazione in vitro
MM	Manutenzione mezzi di comunicazione
MII fase ovocita	Metafase II fase ovocita
rFSH	Ricombinante dell'ormone follicolare Stimolare
TBS	Tris soluzione salina tamponata
TIU	Unità tripsina inibitorio

Tabella 1. Abbreviazioni

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Discussione

Il metodo presentato follicolo ovarico incapsulamento in una FA-IPN consente cultura follicolo in un ambiente 3D in vitro. Un FA-IPN è un processo dinamico, cellula-reattiva matrice in cui sono determinati le proprietà iniziali meccaniche dalla combinazione di entrambi fibrina e alginato. Durante la cultura, il follicolo incapsulato attiva proteasi che degradano solo una componente del IPN, la fibrina, che si traduce in una rigidità gel gradualmente decrescente che ha contribuito unicamente dal alginato che ...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fetuin	Sigma-Aldrich	F3385
FBS	Invitrogen	10082-139
Aprotinin	Roche Group	10236624001
CaCl2	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	039-00475	40 mM
EGF	Sigma-Aldrich	A412
rFSH	National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases
hCG	Sigma-Aldrich	CG-5
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	A1603
ITS	Sigma-Aldrich	I1884-1VL
L-15	GIBCO, by Life Technologies	11415
αMEM+Gluta MAX	GIBCO, by Life Technologies	32561
Pen-Strep	Cellgro	30-002-CI
TBS	Pierce, Thermo Scientific	28379
Tisseel Fibrin kit	Baxter Internationl Inc.	921030
Sodium Alginate	FMC BioPolymers	LF200DL	Mw 418kDa