Метод инкапсуляции фолликулов яичников и культуры в протеолитически разложению 3 мерной системы

Резюме

Новый метод инкапсуляции фолликула яичника в 3D фибрин-альгинат взаимопроникающих сети описывается. Эта система сочетает в себе структурную поддержку с протеолитической деградации, чтобы поддержать развитие незрелых фолликулов для получения зрелых яйцеклеток. Этот метод может быть применен к агрегаты культуры клеток для поддержания межклеточных контактов, не ограничивая экспансию.

Аннотация

Яичников фолликул функциональная единица яичников, который выделяет половые гормоны и поддерживает созревания яйцеклетки. В лабораторных методов фолликула предоставить инструмент для моделирования развития фолликула с целью изучения фундаментальной биологии, а далее развивается как метод сохранения фертильности у Клиника ^1-4. Наша культура в пробирке система использует гидрогелей для того, чтобы имитировать родную среду яичников путем поддержания 3D архитектуру, фолликулярная, межклеточных взаимодействий и паракринной понять, что прямое развитие фолликула ^5. Ранее фолликулы были успешно культивируют в альгинат, инертные водорослей полученных полисахарид, желируется с ионами кальция ^6-8. Альгинат гидрогелей образуется при концентрации 0,25% вес / были самыми разрешительной для фолликула культуры, и сохранил высокие развития компетенции ^9. Альгинат гидрогели, не разлагаются, таким образом, увеличение диаметра фолликула приводит к сжимающей силы на фолликул, что может повлиять на рост фолликулов ^10. Мы впоследствии развилась культура система, основанная на фибрин-альгинат взаимопроникающих сети (FA-IPN), в котором смесь фибрина и альгината геля одновременно. Эта комбинация обеспечивает динамический механический окружающую среду, так как компоненты способствуют матрицы жесткости изначально, однако, протеазы выделяются растущие фолликулы ухудшить фибрина в матрицу, оставляя только альгинат оказать поддержку. С IPN, альгинат содержание может быть меньше 0,25%, что невозможно с альгинат только ^5. Таким образом, как фолликула расширяется, он будет испытывать снижение сжимающего усилия в связи с пониженным содержанием твердых веществ. Здесь мы опишем метод инкапсуляции и в пробирке культуру системы фолликулы в FA-IPN. Динамического механического среды имитирует природную среду яичников, в которых небольшие фолликулы находятся в жесткой коре и перейти к более либеральные мозга, как они увеличиваются в размерах ^11. Разложению компонент может быть особенно важно для клинической перевод, чтобы поддержать более 10 ^{6-кратное} увеличение объема, что человеческая фолликулов обычно проходят в естественных условиях.

протокол

1. Фолликул Изоляция

Эксперименты на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами и правилами, установленными Национальным институтом здоровья Руководство по уходу и использованию лабораторных животных и созданы институциональные Использование животных и уход протокола в Северо-западном университете.

Для получения оптимальных результатов, все вскрытия проводятся в L15 средств массовой информации для контроля рН при комнатной уровней СО ₂ на 37 ° С подогревом этапов для регулирования температуры, и на чистом столе, чтобы минимизировать бактериального загрязнения. Рассечение СМИ (DM) готовят с L15 среде с 50 МЕ / мл пенициллина и 50 мкл / мл стрептомицина и 1% FBS. Техническое обслуживание средств массовой информации (ММ) получают со средствами массовой информации αMEM дополнена с 50 МЕ / мл пенициллина и 50 мкл / мл стрептомицина и 1% FBS.

1. Передача свежей расчлененный яичники из 16 дневных мышей в новую 35-мм чашки Петри с 1-2 мл мм, содержащий 0,1 Коллагеназа% и 0,1% ДНКазы. Инкубировать 15 минут в термостат при температуре 37 ° С и 5% СО _2.
2. После инкубации выполнять несколько этапов промывки в немецких марках, чтобы удалить коллагеназы, а затем переносить их на 35 мм чашки Петри со свежей DM. Изолировать фолликулов из яичника, аккуратно стряхивая (или резки) фолликулы от целого яичника с помощью двух 28 5 / 8 иглы прилагается к одноразовым шприцам. Удалить столько стромы насколько это возможно без повреждения целостности фолликула. Рассеките из 20-40 вторичных фолликулов в яичниках (130-150мм). Эти фолликулы, как правило, 2-3 слоя в соматических клетках.
3. Добавьте 1 мл мм в центральную лунку 60 мм ЭКО (экстракорпоральное оплодотворение) чашки Петри, и 3 мл мм для внешнего кольца. Передача нетронутыми фолликулов с пипеткой внешнее кольцо блюдо ЭКО кратко промыть, а затем выборочно перенести их в центральной яме (см. 1.4). Хранить ЭКО блюдо в инкубаторе.
4. После того как все фолликулы собраны, выбор шаг выполняется под микроскопом рассекает с 5-8-кратным увеличением. Здоровые фолликулы имеют следующие морфологические характеристики:
   • 2-3 слоя соматических клеток
   • 130-150 мм
   • Нет разделения между ооцитов и соматических клеток
   • Неповрежденными и круглые ооцитов
     Передача здоровых фолликул в центре ЭКО блюда для инкапсуляции.

2. Фолликул инкапсуляции, метод 1 - "The Drop Method"

1. Добавьте 1 мл 50 МЕ / мл тромбина в TBS с 40 мМ CaCl ₂ в середину ямы ЭКО блюдо. Оттепель и держать акции фибриногена (50 мг / мл в TBS) на льду. Принесите фибриногена до комнатной температуры перед использованием.
2. Подготовка фибриногена / альгинат решение путем смешивания 1x PBS, 0,5% альгината в растворе PBS и 50 мг / мл раствор фибриногена в соотношении 2:1:1 в 1,7 мл стерильной пробирке микроцентрифужных. Избегайте введения пузырьков в раствор. Аккуратно вихря и со спином вниз. Решение представляется немного облачно и следует готовить непосредственно перед применением.
3. Поставьте две капли фибриногена / альгинат решение внешнего кольца блюдо ЭКО: 90 мкл капли для инкапсуляции и 10 мкл капли для стирки. Чтобы уменьшить испарение, выключите стадии нагрева на вскрытии микроскопом. Передача 10-15 фолликулов в 10 мкл капли с минимальным количеством питательных сред (<5 мкл) с использованием 200 мкм микропипетки наконечник, и быстро перемешать. Передача всех фолликулов в 90 мкл капли с минимальным количеством раствора (<5 мкл) с первой капли, и все перемешать.
4. Одновременно аспирата один фолликул и 5 мкл фибриногена / альгинат решения с использованием 10 мкл кончика пипетки, а выпуск в тромбин / Ca ^{2 +} раствор в блюдо ЭКО. Повторите этот шаг, пока все фолликулы инкапсулируются.
5. Перекрестная ссылка бисером в течение 5-7 минут в тромбин / Ca ^{2 +} решение. Бисер станет темнее как гели фибрина. Передача бисером в чашку Петри с ММ, начиная с темным бисером в первую очередь. Инкубируйте блюдо в течение 15-30 минут inthe инкубатор, чтобы смыть оставшийся тромбина.
6. Передача бусины в 96 ячейках культуры, содержащие 100 мкл среды рост фолликулов, и изображение сразу. Питательной среды (GM) готовится со средствами массовой информации αMEM с добавлением 10 мМЕ / мл рекомбинантного ФСГ, 3 мг / мл БСА, 1 мг / мл бычьего fetuin, 5 мкг / мл инсулина, 5 мкг / мл трансферрина, и 5 нг / мл селена.

3. Фолликул инкапсуляции, метод 2 - "Метод парафильмом"

1. Подготовка фибриногена / альгинат решение путем смешивания 0,5% раствор альгината и 50 мг / мл раствор фибриногена в соотношении 1:1 в 1,7 мл стерильной пробирке микроцентрифужных.
2. Внесите 7,5 мкл капель фибриногена / альгинат смесь на парафильмом покрытием предметное стекло толщиной 3 мм распорки. Передача 1 фолликула в каждой капле с минимумовл количество средств массовой информации.
3. Добавить 7,5 мкл тромбина / Са ^{2 +} для решения каждой капли. Смешивание нет необходимости, поскольку гель образует почти мгновенно.
4. Обложка гели с второй парафильмом покрытием предметное стекло, положить слайды с ног на голову в 100 мм блюдо Петри, и трансфер в инкубаторе в течение 5 минут.
5. Передача бисером в чашку Петри с ММ, а затем в культуре также как описано выше. Если бисером слипаются, что связано с сшивок между бисером, они могут быть отделены осторожно щипцами.

4. Фолликул изображениями и медиа изменения

1. Каждые 2 дня, культурный фолликулы отображаемого использованием светового микроскопа и фолликул диаметром измеряется с помощью программного обеспечения ImageJ.
2. Каждые 2 дня, половина из питательной среды (50 мкл) заменяется свежим, предварительно уравновешенную питательной среды.

5. Фолликул Восстановление после 3D Matrix и в пробирке созревание ооцитов (IVM)

1. Через 8 дней культуры, гидрогели выглядят четкими в связи с полной деградации фибрина компонент, и фолликулы расширить до диаметра 300-400 мкм. Остальные альгинат разлагается под альгинат-лиазы, растительного происхождения, фермент, который специально ухудшает альгинат и не влияет на клетки животных.
2. Удалить питательной среды из скважин содержащих бисером и добавить 100 мл 10 МЕ / мл лиазы альгината в αMEM. Оставьте пластину в инкубаторе в течение 25-30 минут.
3. Удалить фолликулы от растворенных бисер с тупым кончиком конца. Передача первых внешнее кольцо блюдо ЭКО содержащих ДМ, а затем и в центре хорошо, также содержащие ДМ мыть.
4. После мытья, передача фолликулов к внешнему, а затем внутреннее кольцо блюдо ЭКО содержащие созревания СМИ. В средствах массовой информации пробирке созревания (IVM) состоит из αMEM, 10% FCS, 1,5 МЕ / мл ХГЧ, и 5 нг / мл эпидермального фактора роста (EGF)
5. Трансфер в CO ₂ инкубаторе в течение 15-16 часов.
   Изучить фолликулов для расширения кучевые клеток. Чтобы удалить клетки кумулюса из яйцеклетки, добавьте растворе гиалуронидазы до конечной концентрации 0,1 мг / мл и инкубируют в термостате в течение 2-3 минут. Используйте 75 мм кончика микропипетки стричь кучевые клеток из яйцеклетки с помощью пипетки вверх и вниз несколько раз. Определить период созревания ооцита при свете или рассекает микроскопом. Возможных этапах, от наименее до наиболее зрелых, являются:
   • Выродились. Ооцит раздроблена на две или более частей.
   • Зародышевого пузырька (GV) стадии. Ооцитов не возобновлялся мейоза в ответ на ХГЧ воздействия, о чем свидетельствует продолжающееся присутствие ядра яйцеклетки (GV).
   • Жерминаль пробоя пузырек (GVBD). Ядерная мембрана отсутствует яйцеклетки, но нет полярной настоящее тело. Таким образом, яйцеклетка остается в мейозе-I.
   • Метафаза-II арестован ооцитов (MII). Ооцитов возобновил мейоз, и в настоящее время арестован в метафазе-II. Полярное тело должны быть видны на светлом или рассекает микроскопом. Яйцеклетки останутся на MII, если оплодотворение в последующих опытах.

6. Представитель Результаты:

Мы описали новый метод инкапсуляции фолликулы в FA-IPN для культуры в пробирке (рис. 1). Яичников фолликул состоит из яйцеклетки в окружении нескольких слоев в соматических клетках. Связь между несколькими сотовой отсеков имеет важное значение для здорового развития фолликула и созревания яйцеклетки. Фолликул инкапсуляции в 3D гидрогеля поддерживает фолликула расширение при сохранении архитектуры фолликула ^9,11,12. Как фолликулы развиваются, их объем расширяется экспоненциально и инкапсуляции биоматериала должно позволить это расширение без развития ингибирования сжимающей силы. FA-ВПС является сеть, построенную из двух природных материалов, где фибрин протеолитически разложению по плазмин активируется фолликула и альгината биологически инертен ¹³ (рис. 2). Во время роста фолликула, фибрин деградация начинается локально вблизи фолликула, и продолжается до фибрина очищается от гидрогеля. Не-разложению альгинат компонент, который остается неизменным во всем культуры периода, поддерживает 3D-структура гидрогеля.

Фолликулы были изолированы в средней стадии развития (150-180 мкм в диаметре) и расширен до 400 мкм при антрального этап развития в FA-IPN гели. С ХГЧ стимуляции, культурный фолликулов могут подвергнуться расширению кучевые клетки, и ооцитов может возобновить мейоз и прогресса в метафазе II для оплодотворения. Эти результаты показывают, что метод инкапсуляции и инкапсуляции материал позволил культуры фолликула и успешного созревания в пробирке (рис. 3).

Фибрин деградации вокруг encapsulated фолликулов начинается в первый день культуры и завершается день 6. Апротинин, растворимый ингибитор плазмина, могут быть использованы для изменения фибрина деградации и расширить механических градиент в инкапсуляции материала (рис. 4). Если фолликул культивируются с 0,01 ТИУ / мл апротинина, фибрин разлагается медленнее в течение первых 4 дней. Тем не менее, фолликулы еще может развиться до стадии антрального и ооцитов остаются компетентными для возобновления мейоза на метафазе II после апротинин является removed.A высокой концентрацией апротинина (0,1 ТИУ / мл) достоверно тормозит фибрина деградации, матрица жесткости предотвращает расширение фолликула и соматических клеток вторжение в матрице не наблюдается.

Рисунок 1. Блок-схема фолликула развития. Яичников фолликул состоит из яйцеклетки в центре города, окруженные одним или несколькими слоями соматических клеток, которые поддерживают развитие яйцеклетки. Как фолликулы развиваются из вторичной по отношению к preovulatory антрального этапе соматических клеток, окружающих ооцит размножаться и дифференцироваться, и яйцеклетка увеличивается в размере. Созревания в пробирке (IVM) является заключительным этапом для фолликула культуры, когда соматические клетки, прилегающих к яйцеклетки, называют кучевые клеток, расширению после ХГЧ стимуляции, и ооцит резюме мейоза и прогрессирует до метафазы II (MII) стадии.

На рисунке 2а. Альгината и фибрин-альгината для 3D культуры фолликула в пробирке. () Альгинат является естественным биоматериал, который подходит для экстракорпорального фолликула культуры из-за его нежного геля и биохимические характеристики, такие как размер ячейки, управляемой жесткостью и биологической инертностью. Альгинат является линейной сополимера полисахарид α-L-гулуроновой кислоты (G) и β-D-маннуроновой кислоты (М). Районы с повторяющимися мономеры G, называется "G-блоки", сшиты в форме гидрогеля в присутствии двухвалентных ионов кальция.

На рисунке 2б. (Би) Малый инкапсулированные фолликулов опыт низкой сжатие силой в альгинат в начале культуры. Однако, как фолликула расширяет перемещенным объем в шарик увеличивается, что приводит к большей сжимающей силы в противоположном направлении расширения фолликул (B-II).

Рис 2в. Цепями индивидуальных полимеров, полностью запутавшись в фибрин-альгинат решение до сшивания. Оба компонента FA-IPN начинают перекрестные ссылки сразу же, как они подвергаются смесь тромбина и кальция.

На рис.3. Блок-схема для изоляции фолликула и инкапсуляции в FA-IPN. Вторичные фолликулы выделяют из 16-дневных мышей (Ai). Репродуктивные органы расчлененный (-II), и изолированных фолликулов передаются на блюдо с обслуживанием средств массовой информации (A-III).

На рисунке 3б падение метод инкапсуляции фолликула в фибриногена решение альгинат (B: I-IV).. Две капли фибриногена-альгинат решение, полоскание каплю (10 мкл) и инкапсуляции падение (90 мкл) пипетируются в блюдо (Bi). Следующая 3-5 фолликулов передаются полоскания падения (B-II). После промывки и СМИ удаление, фолликулы передаются инкапсуляции падения (B-III). Каждый фолликул отсасывают с 5 мкл фибриногена-альгинат решение с 10 мкл кончика пипетки, а затем выбрасываются в тромбин / раствор кальция (B-IV).

3, в. Бусинка сшивки в течение 5 минут. Метод парафильмом для фолликула инкапсуляции в фибриногена решение альгинат (C: I-III). Фибриноген-альгинат решение (7,5 мкл) пипеткой на парафильмом покрытием предметное стекло и фолликулы передаются индивидуально для каждой капли после промывки (Ci, II). Тромбин решение (7,5 мкл) добавляется к каждой капле (C-III).

Рис 3 - е. капли покрыты второй парафильмом покрытием предметное стекло и FA-IPN сшивается в инкубаторе в течение 5 минут. (D) инкапсулированные фолликулов передаются рост средств массовой информации в 96-луночного планшета. (Е) образ инкапсулированные фолликула в FA-IPN (белая стрелка).

Рисунок 4. Фибрин деградации растущей Folliубор. Фолликулы ухудшить фибрина компонент FA-ВПС в течение периода культуры, о чем свидетельствует ясно круг вокруг фолликула. 3D архитектура фолликула при поддержке оставшихся альгината. В день 0 (D0) фибрина не тронута, а матрица вокруг фолликула облачно, через 1 день в культуре (D1) ясно кольцо вокруг фолликула появляется (белая стрелка) и передней фибрина деградации продолжает радиально расширить свое присутствие на день 2 (D2) и 4-й день (D4) культуры.

Рисунок 5. Изображения рост фолликулов. Представителю изображения ofsecondary роста фолликула в FA-ВПС в день 0 (), 4 (В), 6 (C) и 8 (D) культуры. Через 8 дней, антральных фолликулов созревает в пробирке, и в результате ооцитов MII стадии показаны (Е, полярных тело с черными стрелками).

Рисунок 6. Фибрин деградации ингибируется апротинин. Растущие фолликулы на 2 дня, 4, 10 и 12 показаны в первом ряду. Апротинин в концентрации 0,01 ТИУ / мл (второй ряд) и 0,1 ТИУ / мл был добавлен в культуре средств массовой информации на 0, 2 и 4. Только фолликула культур с 0,01 ТИУ / мл апротинина деградированных фибрина после удаления апротинин и достиг антрального стадии. Фолликулы культивировали в 0,1 ТИУ / мл апротинина не растут в FA-IPN.

Аббревиатура	Полное имя
CO 2 инкубаторе	37 ° C инкубаторе с 5% CO 2
COC	Cumulus яйцеклетки комплекс
3D	3 мерных
DM	Препарирование СМИ
ЭФР	Эпидермального фактора роста
FA-IPN	Фибрин-альгинат взаимопроникающих сети
FBS	Эмбриональной телячьей сыворотки
GM	Рост средств массовой информации
Г. В.	Зародышевого пузырька
ХГЧ	Человеческий хорионический гонадотропин
ЕЕ	Инсулин трансферрина Селен дополнения
ЭКО блюдо	Центр также 60 мм блюдо экстракорпорального оплодотворения
ММ	Обслуживание средств массовой информации
MII стадии ооцита	Метафаза II стадии ооцита
rFSH	Рекомбинантный гормон Фолликулярная
TBS	Трис солевой буфер
ТИУ	Трипсин тормозных единиц

Таблица 1. Сокращения

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Представлены фолликула яичника метод инкапсуляции в FA-IPN позволяет фолликула культуры в 3D-среде в пробирке. FA-ВПС является динамическим, сотовых проблематику матрицу, в которой начальная механические свойства которых определяются комбинацией обоих фибрина и альгината. В культур?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fetuin	Sigma-Aldrich	F3385
FBS	Invitrogen	10082-139
Aprotinin	Roche Group	10236624001
CaCl2	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	039-00475	40 mM
EGF	Sigma-Aldrich	A412
rFSH	National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases
hCG	Sigma-Aldrich	CG-5
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	A1603
ITS	Sigma-Aldrich	I1884-1VL
L-15	GIBCO, by Life Technologies	11415
αMEM+Gluta MAX	GIBCO, by Life Technologies	32561
Pen-Strep	Cellgro	30-002-CI
TBS	Pierce, Thermo Scientific	28379
Tisseel Fibrin kit	Baxter Internationl Inc.	921030
Sodium Alginate	FMC BioPolymers	LF200DL	Mw 418kDa