Um método para Encapsulation ovário folículo e Cultura em um proteoliticamente Degradáveis ​​3 Sistema Dimensional

Resumo

Um novo método para encapsulação de ovário folículos em uma rede de fibrina 3D alginato-interpenetrantes é descrito. Este sistema combina suporte estrutural, com a degradação proteolítica para apoiar o desenvolvimento de folículos imaturos para produzir ovócitos maduros. Este método pode ser aplicado a agregados de cultura de células para manter contatos célula-célula sem limitar a expansão.

Resumo

O folículo ovariano é a unidade funcional do ovário que secreta hormônios sexuais e suporta maturação de oócitos. Em técnicas folículo vitro fornecer uma ferramenta para o desenvolvimento folicular modelo a fim de investigar a biologia básica, e são ainda a ser desenvolvido como uma técnica para preservar a fertilidade do clínica ^1-4. Nosso sistema de cultura in vitro emprega hidrogéis, a fim de imitar o ambiente nativo do ovário, mantendo a arquitetura folicular 3D, interações célula-célula e sinalização parácrina que o desenvolvimento folicular direta ^5. Anteriormente, os folículos foram cultivados com sucesso em alginato, um polissacarídeo derivado de algas inerte que sofre gelificação com íons de cálcio ^6-8. Hidrogéis de alginato formado em uma concentração de 0,25% w / v foram os mais permissiva para a cultura do folículo, e manteve a mais alta competência de desenvolvimento ^9. Hidrogéis de alginato não são biodegradáveis, portanto, um aumento nos resultados folículo de diâmetro em uma força de compressão sobre o folículo que podem impactar o crescimento do folículo ^10. Nós posteriormente desenvolvido um sistema de cultura baseado numa rede de fibrina alginato-interpenetrantes (FA-IPN), em que uma mistura de alginato de fibrina e são gelled simultaneamente. Esta combinação fornece um ambiente dinâmico mecânica, porque os dois componentes contribuem para a rigidez da matriz, inicialmente, no entanto, proteases secretadas pelo folículo crescente degradação de fibrina na matriz de alginato deixando apenas para prestar apoio. Com o IPN, o conteúdo de alginato pode ser reduzida abaixo de 0,25%, o que não é possível com alginato sozinho ^5. Assim, como o folículo se expande, ele vai experimentar uma força de compressão reduzida devido ao teor de sólidos reduzidos. Aqui, descrevemos um método de encapsulamento e um em sistema de cultura in vitro para folículos ovarianos em um FA-IPN. O ambiente dinâmico mecânico imita o ambiente natural em que ovário folículos pequenos residir em um córtex rígido e mover para uma medula mais permissiva à medida que aumentam de tamanho ^11. O componente degradável pode ser particularmente crítica para a tradução clínica, a fim de apoiar o maior aumento de 10 ⁶ vezes no volume que os folículos humano normalmente sofrem in vivo.

Protocolo

1. Isolamento folículo

Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pelo National Institutes of Health Guide para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e Uso Animal, instituído Institucional e protocolo de atendimento na Northwestern University.

Para melhores resultados, todas as dissecções são realizadas em L15 de mídia para o controle de pH a níveis ambientais de CO _2, em 37 ° C estágios aquecida para controle de temperatura, e em uma bancada limpa para minimizar a contaminação bacteriana. A mídia dissecção (DM) é preparado com L15 meio suplementado com 50 UI / mL de penicilina e estreptomicina 50 mL / mL e 1% de SFB. Os meios de comunicação de manutenção (MM) é preparado com a mídia αMEM suplementado com 50 UI / mL de penicilina e estreptomicina 50 mL / mL e 1% de SFB.

1. Transferência de ovários recém-dissecado de 16 dias mouse antigo em um prato de 35 milímetros nova Petri com 1-2 MM mL contendo 0,1% de colagenase e DNase 0,1%. Incubar por 15 minutos dentro de uma incubadora a 37 ° C e 5% CO _2.
2. Após a incubação, realizar várias etapas de lavagem no DM para remover colagenase, e depois transferir para uma placa de Petri 35 mm com DM fresco. Isolar folículos do ovário suavemente flicking (ou corte) longe de folículos do ovário inteiro usando duas agulhas calibre 28 08/05 anexado a seringas descartáveis. Remover o estroma tanto quanto possível, sem prejudicar a integridade do folículo. Dissecar 20-40 folículos secundários por ovário (130-150mm). Estes folículos geralmente têm 2-3 camadas de células somáticas.
3. Adicionar 1 mL MM para o poço central de uma 60 milímetros FIV (fertilização in vitro) placa de Petri, e 3 MM mL para o anel externo. Transferência de folículos intacto com uma pipeta para o anel externo do prato FIV brevemente enxágüe, em seguida, seletivamente transferi-los para o bem central (Ver 1.4). Armazenar este prato FIV na incubadora.
4. Depois de todos os folículos são coletados, a etapa de seleção é realizada sob um microscópio de dissecação com uma ampliação de 5 8x. Folículos saudáveis ​​têm as seguintes características morfológicas:
   • 2-3 camadas de células somáticas
   • 130-150 milímetros
   • Há separação entre oócito e células somáticas
   • Oócitos intactos e redondo
     Transferir os folículos saudáveis ​​para o centro dos pratos de fertilização in vitro para encapsulamento.

2. Encapsulation folículo, Método 1 - "O Método Drop"

1. Adicionar 1 mL de 50 UI / ml de trombina em TBS com 40 mM CaCl ₂ para o meio do prato bem fertilização in vitro. Descongelar e manter estoque de fibrinogênio (50 mg / mL em TBS) no gelo. Trazer o fibrinogênio direito à temperatura ambiente antes de usar.
2. Prepare a solução de fibrinogênio / alginato, misturando 1x PBS, alginato de 0,5% em solução de PBS e 50 mg / mL solução de fibrinogênio na proporção 02:01:01 em um tubo de microcentrífuga 1,7 mL estéril. Evitar a introdução de bolhas na solução. Suavemente vórtice e spin-down. A solução parece um pouco nublado e deve ser preparada imediatamente antes do uso.
3. Coloque duas gotas de fibrinogênio / solução de alginato no anel externo de um prato de fertilização in vitro: uma gota de 90 mL de encapsulamento e uma gota de 10 mL para a lavagem. Para diminuir a evaporação, desligue o estágio de aquecimento no microscópio de dissecação. Transferência 10-15 folículos para a gota de 10 L com um mínimo de meios de cultura (<5 mL), utilizando uma micropipeta ponta 200 mM, e rapidamente mix. Transferência de todos os folículos para a gota de 90 mL com uma quantidade mínima de solução (<5 mL) a partir da primeira gota, e misturar.
4. Ao mesmo tempo aspirar um folículo e 5 mL de fibrinogênio / alginato solução usando a 10 mL ponta da pipeta, ea liberação para a solução de trombina ⁺ / Ca ² no prato fertilização in vitro. Repita este passo até que todos os folículos são encapsulados.
5. Cross-link as contas por 5-7 minutos na solução de trombina ⁺ / Ca ^2. As contas vão ficar mais escura como géis de fibrina. Transferir as contas em uma placa de Petri contendo MM, começando com as contas mais escura primeiro. Incubar o prato por 15-30 minutos inthe incubadora para enxaguar a trombina restantes.
6. Transferir as contas em uma placa de cultura de 96 poços contendo 100 mL de meio de crescimento do folículo, ea imagem imediatamente. O meio de crescimento (GM) está preparada com uma mídia αMEM suplementado com 10 mIU / mL de FSH recombinante, 3 mg / mL de BSA, 1 mg / mL de bovinos fetuína, 5 mg / mL de insulina, 5 mg / mL de transferrina, e 5 ng / mL de selênio.

3. Encapsulation folículo, Método 2 - "O Método Parafilm"

1. Prepare a solução de fibrinogênio / alginato, misturando solução de alginato de 0,5% e 50 mg / mL solução de fibrinogênio em uma proporção de 1:1 em um tubo de microcentrífuga 1,7 mL estéril.
2. Pipetar 7,5 mL gotas da mistura de fibrinogênio / alginato em uma lâmina de vidro revestidas com parafilme três espaçadores mm. Transferência de um folículo em cada gota, com uma mínimosl quantidade de meios de comunicação.
3. Adicionar 7,5 mL de trombina / Ca ^{2 +} solução de cada gota. Mistura é desnecessário porque o gel formas quase que instantaneamente.
4. Cobrir o gel com a segunda lâmina de vidro revestido parafilme, coloque as lâminas de cabeça para baixo em um prato de 100 milímetros Petri, e transferir para a incubadora por 5 minutos.
5. Transferir as contas em uma placa de Petri contendo MM, e depois para a cultura assim como descrito anteriormente. Se as contas ficar juntos, o que é devido ao cross-linking entre as contas, elas podem ser separadas gentilmente com uma pinça.

4. Imagem do folículo e Mudança de Mídia

1. A cada 2 dias, os folículos cultivados são gravadas usando um microscópio de luz eo diâmetro do folículo é medido com o software programa ImageJ.
2. A cada 2 dias, metade dos meios de crescimento (50 mL) é substituído pelo novo, a mídia pré-equilibrada de crescimento.

5. Recuperação do folículo da Matrix 3D e in vitro maturação de oócitos (IVM)

1. Após 8 dias de cultura, os hidrogéis aspecto límpido, devido à completa degradação do componente de fibrina, e os folículos expandir-se para um diâmetro de 300-400 mM. O alginato restante é degradado por alginato-liase, uma enzima de origem vegetal que degrada especificamente alginato e não afeta as células animais.
2. Remova a mídia de crescimento de poços contendo as contas e adicionar 100 mL de 10 IU / mL em alginato liase αMEM. Deixar a placa na incubadora por 25-30 minutos.
3. Remover folículos dos grânulos dissolvidos com uma ponta final brusco. Primeira transferência para o anel externo de um prato contendo IVF DM, e depois para o centro de bem, também contendo DM para se lavar.
4. Após a lavagem, transferir os folículos para o exterior, e, em seguida, anel interno de um prato de fertilização in vitro contendo meio de maturação. No meio de maturação in vitro (IVM) é composto de αMEM, 10% SFB, 1,5 UI / mL de hCG, e 5 ng / mL do fator de crescimento epidérmico (EGF)
5. Transferência para incubadora de CO ₂ para 15-16 horas.
   Examine os folículos para a expansão das células do cumulus. Para remover as células cumulus dos oócitos, adicione a solução de hialuronidase a concentração final de 0,1 mg / mL e incube na incubadora por 2-3 minutos. Use uma ponta micropipeta 75 mm para as células cumulus cisalhamento do oócito pipetando cima e para baixo várias vezes. Determinar estágio de maturação do ovócito sob uma luz ou um microscópio de dissecação. Os estágios possíveis, menos para o mais maduro, são:
   • Degenerados. O oócito é fragmentada em duas ou mais peças.
   • Vesícula germinativa (GV) palco. O ovócito não retomar a meiose em resposta à exposição hCG, que é evidente pela presença contínua do núcleo do oócito (GV).
   • Rompimento da vesícula germinativa (GVBD). A membrana nuclear está ausente do oócito, mas não há nenhum presente corpo polar. Portanto, o óvulo ainda está em meiose-I.
   • Metáfase II de oócitos-presos (MII). Retomada da meiose do oócito, e agora está preso em metáfase II. Um corpo polar deve estar visível em uma luz ou um microscópio de dissecação. O ovócito permanecerá em MII, a menos fertilizados em experimentos posteriores.

6. Resultados representativos:

Nós descrevemos um método de encapsulamento romance de folículos ovarianos em um FA-IPN para a cultura in vitro (Figura 1). Folículos ovarianos consistem de um oócito rodeado por diversas camadas de células somáticas. Comunicação entre os vários compartimentos celulares é essencial para o desenvolvimento folicular saudável e maturação de oócitos. Encapsulamento folículo em um hidrogel 3D suporta expansão do folículo, mantendo a arquitetura do folículo ^9,11,12. Como folículos se desenvolvem, seu volume se expande exponencialmente eo biomaterial encapsular deve permitir que esta expansão sem o desenvolvimento de uma força de inibir a compressão. FA-IPN é uma rede construída com dois materiais naturais, onde a fibrina é proteoliticamente degradáveis ​​pela plasmina ativada pelo folículo e alginato é biologicamente inerte ¹³ (Figura 2). Durante o crescimento do folículo, degradação da fibrina começa localmente perto do folículo, e continua até que a fibrina é eliminado do hidrogel. O componente alginato não-degradáveis, que permanece intacta durante todo o período da cultura, apoia a estrutura 3D do hidrogel.

Folículos foram isolados no estágio secundário de desenvolvimento (150-180 diâmetro mm) e se expandiu para 400 m na fase antral de desenvolvimento no gel FA-IPN. Com estimulação hCG, os folículos cultivados pode sofrer expansão de células cumulus e oócitos pode retomar a meiose e progredir para metáfase II para a fertilização. Estes resultados sugerem que o método de encapsulamento e encapsular o material permitido cultura folículo e maturação de sucesso in vitro (Figura 3).

Degradação da fibrina em torno do de encapsulamentofolículos ated começa no primeiro dia da cultura e é completado por dia 6. Aprotinina, um inibidor da plasmina solúvel, pode ser usada para alterar degradação da fibrina e estender gradiente mecânicos no material do encapsulamento (Figura 4). Se folículos são cultivadas com 0,01 TIU / mL aprotinina, a fibrina é degradada mais lento durante os primeiros 4 dias. No entanto, os folículos ainda pode evoluir para o estágio antral e ovócitos continuam a ser competentes para retomar a meiose para metáfase II após a aprotinina é removed.A alta concentração de aprotinina (0,1 TIU / mL) inibe significativamente a degradação da fibrina, a rigidez da matriz impede a expansão do folículo e de células somáticas invasão na matriz é observado.

Figura 1. Fluxograma do desenvolvimento folicular. O folículo ovariano é constituído por um oócito localização central rodeado por uma ou mais camadas de células somáticas, que apoiem o desenvolvimento do oócito. Como folículos se desenvolvem a partir secundário para o estágio pré-ovulatório antral, as células somáticas em torno do oócito proliferam e se diferenciam, e do oócito aumenta de tamanho. Maturação in vitro (IVM) é o passo final para a cultura do folículo, quando as células somáticas adjacentes ao oócitos, denominadas células cumulus, expanda após a estimulação hCG, eo ovócito retoma a meiose e progride para uma metáfase II (MII) palco.

Figura 2a. Alginato e alginato de fibrina para a cultura do folículo 3D in vitro. (A) alginato é um biomaterial natural que é adequado para a cultura in vitro folículo devido à sua gelificação gentil e características bioquímicas, tais como o tamanho da malha, a rigidez controlável e inércia biológica. Alginato é um copolímero de polissacarídeo linear de α-L-ácido gulurônico (G) e ácido-mannuronic D-β (M). Áreas com monômeros G repetindo, denominado "G-blocks", são ligadas para formar um hidrogel na presença de íons de cálcio divalente.

Figura 2b. (Bi) Small folículos encapsulado experiência força de compressão baixa em alginato no início da cultura. No entanto, como o folículo se expande o volume deslocado no talão está aumentando, o que resulta em maior força de compressão na direção oposta da expansão do folículo (b-ii).

Figura 2c. As cadeias de polímeros individuais são completamente enredado na solução de alginato de fibrina-antes do cross-linking. Ambos os componentes da FA-IPN começar a cross-link imediatamente como eles são expostos à mistura de trombina e do cálcio.

Figura 3a. Fluxograma para o isolamento de folículos e encapsulamento em um FA-IPN. Folículos secundários são isolados a partir de um rato de 16 dias de idade (Ai). Os órgãos reprodutivos são dissecados (A-II), e os folículos isolados são transferidos para um prato com media de manutenção (A-III).

Figura 3b O método da gota para encapsulamento folículo em solução de alginato de fibrinogênio (B: i-iv).. Duas gotas de solução de alginato de fibrinogênio, a queda de lavagem (10 mL) ea queda de encapsulação (90 mL) são pipetados o prato (Bi). Próximos 3-5 folículos são transferidos para uma gota de lavagem (B-ii). Após a lavagem e remoção de mídia, os folículos são transferidos para a queda de encapsulamento (B-iii). Cada folículo é aspirado com 5 fibrinogênio solução de alginato-mL com uma ponteira de 10 L e, em seguida, expulsos em trombina / cálcio solução (B-iv).

Figura 3c. O talão ligações cruzadas por 5 minutos. O método de parafilme para encapsulamento folículo em solução de alginato de fibrinogênio (C: i-iii). Fibrinogênio alginato de solução (7,5 mL) é pipetado sobre a lâmina de vidro revestido e parafilme folículos são transferidos individualmente para cada gota após a lavagem (Ci, ii). Trombina solução (7,5 mL) é adicionado a cada gota (C-III).

Figura 3d - e. As gotas são cobertas com um segundo lâmina de vidro revestido e parafilme a FA-IPN é reticulado na incubadora por 5 minutos. (D) Os folículos encapsulados são transferidos para meios de crescimento em uma placa de 96 poços. (E) Uma imagem de um folículo encapsulada na FA-IPN (seta branca).

Figura 4. Degradação da fibrina pela crescente Follicle. Folículos degradar a componente de fibrina do FA-IPN durante o período de cultura, que é demonstrado por um círculo em volta do folículo. Arquitetura 3D do folículo é suportado pelo alginato restantes. No dia 0 (D0) a fibrina ainda está intacta ea matriz em torno do folículo é nublado, depois de um dia na cultura (D1) o anel de clara em torno do folículo aparece (seta branca) e à frente de degradação da fibrina continua a expandir radialmente no dia 2 (D2) e dia 4 (D4) da cultura.

Figura 5. Imagens do crescimento folicular. Representante imagens crescimento folicular ofsecondary na FA-IPN no dia 0 (A), 4 (B), 6 (C) e 8 (D) da cultura. Depois de oito dias, os folículos antrais foram maturados in vitro, e os oócitos MII estágio resultantes são mostrados (E, o corpo polar é mostrado com a seta preta).

Figura 6. Degradação da fibrina foi inibida pela aprotinina. Growing folículos no dia 2, 4, 10 e 12 são mostradas na primeira linha. Aprotinina em concentrações 0,01 TIU / mL (segunda linha) e 0,1 TIU / mL foi adicionada ao meio de cultura nos dias 0, 2 e 4. Só folículo culturas com 0,01 TIU / mL aprotinina fibrina degradada após a remoção da aprotinina e atingiu a fase antral. Folículos cultivados em 0,1 TIU / mL aprotinina não cresceu na FA-IPN.

Abreviatura	Nome completo
Incubadora de CO 2	37 ° C incubadora com 5% de CO 2
COC	Cumulus complexo oócito
3D	3 dimensional
DM	Media dissecção
EGF	Fator de crescimento epidérmico
FA-IPN	Fibrina alginato de rede interpenetrante
FBS	Soro fetal bovino
GM	Meios de crescimento
GV	Vesícula germinativa
hCG	Gonadotrofina coriônica humana
ITS	Insulina Transferrina suplemento de selênio
Prato de fertilização in vitro	Centro de bem 60 milímetros in vitro prato fertilização
MM	Meios de manutenção
MII de oócitos estágio	Metáfase II de oócitos estágio
rFSH	Hormônio recombinante Folicular Estimulante
TBS	Tris salina tamponada
TIU	Unidades de tripsina inibitória

Tabela 1. Abreviações

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Discussão

O ovário apresenta método de encapsulamento em um folículo FA-IPN permite folículo cultura em um ambiente 3D in vitro. A FA-IPN é um processo dinâmico, a matriz de células de resposta em que as propriedades mecânicas iniciais são determinados pela combinação de ambos fibrina e alginato. Durante a cultura, o folículo encapsulado ativa proteases que degradam apenas um componente do IPN, a fibrina, que resulta em um gel, diminuindo gradualmente a rigidez que é contribuição apenas pelo alginato reman...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fetuin	Sigma-Aldrich	F3385
FBS	Invitrogen	10082-139
Aprotinin	Roche Group	10236624001
CaCl2	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	039-00475	40 mM
EGF	Sigma-Aldrich	A412
rFSH	National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases
hCG	Sigma-Aldrich	CG-5
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	A1603
ITS	Sigma-Aldrich	I1884-1VL
L-15	GIBCO, by Life Technologies	11415
αMEM+Gluta MAX	GIBCO, by Life Technologies	32561
Pen-Strep	Cellgro	30-002-CI
TBS	Pierce, Thermo Scientific	28379
Tisseel Fibrin kit	Baxter Internationl Inc.	921030
Sodium Alginate	FMC BioPolymers	LF200DL	Mw 418kDa