Une méthode pour l'encapsulation follicule ovarien et de la Culture dans un protéolytiquement dégradable 3 Système dimensionnelle

Résumé

Une nouvelle méthode pour l'encapsulation dans un follicule ovarien 3D fibrine alginate réseau interpénétré est décrite. Ce système combine un soutien structurel à la dégradation protéolytique de soutenir le développement des follicules immatures pour produire des ovocytes matures. Cette méthode peut être appliquée à des agrégats de cellules de culture pour maintenir des contacts cellule-cellule, sans limiter l'expansion.

Résumé

Le follicule ovarien est l'unité fonctionnelle de l'ovaire qui sécrète les hormones sexuelles et soutient la maturation ovocytaire. Dans les techniques in vitro des follicules fournir un outil pour le développement des follicules modèle afin d'étudier la biologie de base, et sont encore en cours de développement comme une technique pour préserver la fertilité dans les Clinique ^1-4. Notre système de culture in vitro emploie hydrogels afin de mimer l'environnement par le maintien de l'ovaire natif de l'architecture folliculaire 3D, interactions cellule-cellule et de signalisation paracrine que le développement folliculaire directe ^5. Auparavant, les follicules ont été cultivés en alginate avec succès, un gaz inerte algues dérivés de polysaccharides qui subit gélification avec les ions calcium ^6-8. Alginate hydrogels formés à une concentration de 0,25% p / v ont été les plus permissives pour la culture de follicule, et conservé la plus haute compétence de développement ^9. Alginate hydrogels sont pas dégradables, donc une augmentation dans les résultats de diamètre folliculaire dans une force de compression sur le follicule qui peuvent influer sur la croissance folliculaire ^10. Nous avons ensuite développé un système de culture basée sur un réseau de fibrine d'alginate interpénétrés (FA-IPN), dans lequel un mélange de fibrine et de l'alginate sont gélifiés simultanément. Cette combinaison offre un environnement dynamique mécanique, car les deux composants contribuent à la rigidité de matrice d'abord, cependant, les protéases sécrétées par le follicule en croissance dégrade la fibrine dans la matrice d'alginate en laissant seulement à fournir un soutien. Avec l'IPN, le contenu d'alginate peut être réduit en dessous de 0,25%, ce qui n'est pas possible avec de l'alginate seuls ^5. Ainsi, comme le follicule se développe, il subira une force réduite à la compression due à la teneur réduite en solides. Nous décrivons ici une méthode d'encapsulation et d'un système de culture in vitro des follicules ovariens dans un FA-IPN. L'environnement mécanique dynamique imite l'environnement naturel dans lequel l'ovaire petits follicules résider dans un cortex rigide et passer à un bulbe plus permissif car ils augmentent en taille ^11. La composante dégradable peut être particulièrement critique pour la traduction clinique, afin de soutenir les plus de 10 ⁶ fois plus en volume que les follicules humains subissent normalement in vivo.

Protocole

1. Isolement Follicule

Expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les directives et règlements établis par les National Institutes of Health Guide pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire et l'utilisation des animaux institutionnelle et des protocoles de soins à la Northwestern University.

Pour des résultats optimaux, toutes les dissections sont réalisées dans les médias L15 pour contrôler le pH à des niveaux ambiants de CO _2, sur 37 ° C stades chauffés pour le contrôle de la température, et sur ​​un établi propre à minimiser la contamination bactérienne. Les médias de dissection (DM) est préparé avec L15 milieux supplémentés avec 50 UI / ml de pénicilline et 50 ug / ml de streptomycine et 1% de FBS. Les médias d'entretien (MM) est préparé avec les médias aMEM supplémenté avec 50 UI / mL de pénicilline et 50 ug / ml de streptomycine et 1% de FBS.

1. Transfert des ovaires de souris fraîchement disséqués ancienne 16 jours dans un nouveau plat de Pétri de 35 mm avec 1-2 MM ml contenant 0,1 collagénase% et 0,1% DNase. Incuber pendant 15 minutes dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO _2.
2. Après incubation, effectuer plusieurs étapes de lavage en DM pour enlever la collagénase, puis transférer dans un plat de Pétri de 35 mm avec des produits frais de DM. Isoler les follicules de l'ovaire par un léger pichenette (ou couper) follicules loin de l'ovaire entier en utilisant deux aiguilles de calibre 28 5 / 8 attachés à des seringues jetables. Retirez le stroma autant que possible sans nuire à l'intégrité du follicule. Disséquer les 20-40 follicules secondaires par ovaire (130-150mm). Ces follicules ont généralement 2-3 couches de cellules somatiques.
3. Ajouter 1 ml MM vers le puits central d'un 60 mm (fécondation in vitro) FIV boîte de Petri, et de 3 mm mL à la bague extérieure. Transfert follicules intacts avec une pipette à la bague extérieure du plat FIV brièvement rincer, puis les transférer de manière sélective dans le puits central (voir 1.4). Magasin de ce plat FIV dans l'incubateur.
4. Après que tous les follicules sont recueillis, l'étape de sélection est effectuée sous une loupe binoculaire avec un grossissement de 5 8x. Follicules sains ont les caractéristiques morphologiques suivantes:
   • 2-3 couches de cellules somatiques
   • 130-150 mm
   • Pas de séparation entre l'ovocyte et les cellules somatiques
   • Ovocytes intacts et rond
     Transférer les follicules sains dans le centre de FIV pour l'encapsulation des plats.

2. Encapsulation follicule, Méthode 1 - «La méthode Drop"

1. Ajouter 1 mL de 50 UI / ml thrombine dans du TBS avec 40 mM de CaCl ₂ dans le milieu même du plat FIV. Décongeler et maintenir le stock fibrinogène (50 mg / mL dans TBS) sur la glace. Amener le fibrinogène à la température ambiante juste avant utilisation.
2. Préparer la solution de fibrinogène / alginate en mélangeant 1x PBS, 0,5% d'alginate dans une solution de PBS et 50 mg / ml solution de fibrinogène à un ratio 02:01:01 dans un tube 1,7 ml microtubes stériles. Évitez d'introduire des bulles dans la solution. Doucement vortex et spin-down. La solution semble légèrement nuageux et doit être préparée immédiatement avant utilisation.
3. Placez deux gouttes du fibrinogène / solution d'alginate dans la bague extérieure d'un plat FIV: une gouttelette 90 uL d'encapsulation et d'une gouttelette 10 uL pour le lavage. Pour diminuer l'évaporation, éteignez l'étape de chauffage sur le microscope à dissection. Transfert 10-15 follicules dans les gouttelettes 10 uL avec une quantité minimale de milieux de culture (<5 uL) en utilisant une pointe 200 um micropipette, et mélanger rapidement. Transfert de tous les follicules dans les gouttelettes 90 pi avec une quantité minimale de solution (<5 uL) de la première goutte, et mélanger.
4. Simultanément aspirer un follicule et 5 pi de fibrinogène / alginate solution en utilisant un pourboire de 10 uL pipette, et le rejet dans la solution de thrombine / Ca ^{2 +} dans le plat de FIV. Répétez cette étape jusqu'à ce que tous les follicules sont encapsulés.
5. Croix-lier les perles pendant 5-7 minutes dans la solution de thrombine / Ca ^{2 +.} Les perles deviennent plus foncées que les gels de fibrine. Transférer les billes dans une boîte de Petri contenant MM, à commencer par les perles sombres premier. Incuber le plat pendant 15-30 minutes INTHE incubateur pour rincer la thrombine restante.
6. Transférer les billes dans une plaque de 96 puits de culture contenant 100 uL de milieu de croissance du follicule, et l'image immédiatement. Les milieux de croissance (GM) est préparé avec les médias aMEM complété avec 10 mUI / mL de la FSH recombinante, 3 mg / ml de BSA, 1 mg / mL de bovins fétuine, 5 ug / ml d'insuline, 5 ug / ml de transferrine, et 5 ng / ml de sélénium.

3. Encapsulation follicule, la méthode 2 - "La Méthode Parafilm"

1. Préparer la solution de fibrinogène / alginate en mélangeant une solution d'alginate de 0,5% et de 50 mg / ml solution de fibrinogène à un ratio 1:1 dans un tube de 1,7 ml à centrifuger stérile.
2. Pipeter 7,5 gouttes ul du mélange de fibrinogène / alginate sur une lame de verre recouverte d'un parafilm 3 entretoises mm. Transférer 1 follicule dans chaque goutte avec un minimamontant L de médias.
3. Ajouter 7,5 ul de thrombine / Ca ^{2 +} solution pour chaque goutte. Le mélange est inutile parce que le gel se forme presque instantanément.
4. Couvrir les gels avec la deuxième diapositive parafilm verre enduit, mettre les diapositives à l'envers dans un plat de Pétri de 100 mm, et transfert à l'incubateur pendant 5 minutes.
5. Transférer les billes dans une boîte de Petri contenant MM, puis dans la culture ainsi que décrit précédemment. Si les perles se serrer les coudes, ce qui est dû à la réticulation entre les billes, ils peuvent être séparés délicatement avec une pince.

4. Imagerie follicule et le changement des médias

1. Tous les 2 jours, les follicules en culture sont imagées en utilisant un microscope optique et le diamètre du follicule est mesuré avec le logiciel ImageJ.
2. Tous les 2 jours, la moitié des milieux de croissance (50 pi) est remplacé par de nouvelles, les milieux de croissance pré-équilibrée.

5. Récupération follicule à partir de la matrice 3D et dans la maturation ovocytaire in vitro (MIV)

1. Après 8 jours de culture, les hydrogels apparaissent clairement en raison de la dégradation complète de la composante de la fibrine, et les follicules expansion à un diamètre de 300-400 um. L'alginate restant est dégradé par l'alginate-lyase, une enzyme d'origine végétale qui dégrade spécifiquement l'alginate et n'affecte pas les cellules animales.
2. Retirez le support de croissance à partir de puits contenant les billes et ajouter 100 ml de 10 UI / alginate lyase mL dans aMEM. Laisser la plaque dans l'incubateur pendant 25-30 minutes.
3. Retirez les follicules des billes dissous avec une pointe extrémité émoussée. Transfert d'abord la bague extérieure d'un plat contenant de FIV DM, et ensuite dans le centre de bien, contenant également des DM pour se laver.
4. Après lavage, transférer les follicules à l'extérieur, et la bague intérieure, puis d'un plat contenant des médias FIV maturation. Dans les médias maturation in vitro (MIV) est composé de aMEM, FCS 10%, à 1,5 UI / mL d'hCG, et 5 ng / ml du facteur de croissance épidermique (EGF)
5. Transfert à l'incubateur à CO ₂ pour 15-16 heures.
   Examiner les follicules des cumulus cellules expansion. Pour enlever les cellules du cumulus de l'ovocyte, ajouter la solution de hyaluronidase à la concentration finale de 0,1 mg / ml et incuber dans un incubateur pendant 2-3 minutes. Utiliser un embout de 75 mm micropipette pour cisailler les cellules du cumulus de l'ovocyte par aspiration et refoulement à plusieurs reprises. Déterminer le stade de maturation de l'ovocyte sous une lumière ou d'un microscope à dissection. Les étapes du possible, du moins au plus matures, sont les suivants:
   • Dégénéré. L'ovocyte est fragmenté en deux ou plusieurs pièces.
   • Vésicule germinale (GV) scène. L'ovocyte ne pas reprendre la méiose en réponse à l'exposition hCG, qui se manifeste par la présence continue du noyau de l'ovocyte (GV).
   • Rupture de la vésicule germinative (GVBD). La membrane nucléaire est absent de l'ovocyte, mais il n'ya pas de présence du corps polaire. Par conséquent, l'ovocyte est toujours en méiose I.
   • Métaphase II ovocyte arrêtés (MII). L'ovocyte a repris la méiose, et est désormais arrêté à la métaphase II. Un globule polaire doit être visible sur une lumière ou un microscope à dissection. L'ovocyte restera au moins PPFI fécondés dans des expériences ultérieures.

6. Les résultats représentatifs:

Nous avons décrit une méthode d'encapsulation roman de follicules ovariens dans un FA-IPN de culture in vitro (figure 1). Follicules ovariens se composent d'un ovocyte entouré de plusieurs couches de cellules somatiques. La communication entre les compartiments cellulaires multiples est essentielle pour le développement des follicules sains et la maturation ovocytaire. Follicule encapsulation dans un hydrogel 3D soutient l'expansion du follicule tout en conservant l'architecture du follicule ^9,11,12. Comme follicules se développent, leur volume augmente de façon exponentielle et l'encapsulation de biomatériau devrait permettre cette expansion sans le développement d'une force de compression inhibant. FA-IPN est un réseau constitué de deux matériaux naturels, où la fibrine est protéolytiquement dégradable par la plasmine activée par le follicule et l'alginate est biologiquement inerte ¹³ (figure 2). Pendant la croissance folliculaire, dégradation de la fibrine commence localement près du follicule, et se poursuit jusqu'à la fibrine est effacé de l'hydrogel. La composante d'alginate non dégradables, qui reste intacte pendant toute la période de la culture, soutient la structure 3D de l'hydrogel.

Les follicules ont été isolés au stade de développement du secondaire (150-180 um de diamètre) et élargi à 400 um au stade antral de développement dans les gels FA-IPN. Avec la stimulation hCG, les follicules en culture peut subir l'expansion des cellules du cumulus, et des ovocytes peut reprendre la méiose et le progrès à la métaphase II pour la fertilisation. Ces résultats suggèrent que la méthode d'encapsulation et le matériau d'encapsulation a permis la culture et de la maturation du follicule succès in vitro (figure 3).

Dégradation de la fibrine autour du encapsulfollicules ATED commence le premier jour de la culture et est complété par jour 6. L'aprotinine, un inhibiteur de la plasmine soluble, peut être utilisée pour modifier dégradation de la fibrine et d'étendre gradient mécanique dans le matériau d'encapsulation (figure 4). Si les follicules sont cultivés avec 0,01 TIU / ml d'aprotinine, la fibrine est plus lent dégradé pour les 4 premiers jours. Néanmoins, les follicules peuvent encore se développer jusqu'au stade antral et des ovocytes restent compétents pour reprendre la méiose pour métaphase II après l'aprotinine est removed.A forte concentration d'aprotinine (0,1 TIU / ml) inhibe significativement dégradation de la fibrine, matrice de rigidité empêche l'expansion du follicule et de cellules somatiques l'invasion dans la matrice est observée.

Figure 1. Organigramme du développement des follicules. Le follicule ovarien est constitué d'un ovocyte situé entouré par une ou plusieurs couches de cellules somatiques, qui soutiennent le développement des ovocytes. Comme les follicules se développent à partir du secondaire à la phase pré-ovulatoire antrale, les cellules somatiques entourant l'ovocyte prolifèrent et se différencient, et l'ovocyte augmente de taille. Maturation in vitro (MIV) est la dernière étape pour la culture du follicule, lorsque les cellules somatiques adjacent à la ovocyte, appelée cellules du cumulus, développez après stimulation hCG, et l'ovocyte reprend la méiose et évolue vers une métaphase II (MII) scène.

Figure 2a. Alginate et de fibrine d'alginate pour la culture du follicule 3D in vitro. (A) d'alginate est un biomatériau naturel qui convient à la culture in vitro des follicules en raison de sa douceur de gélification et les caractéristiques biochimiques, telles que le maillage, la rigidité et l'inertie contrôlables biologique. Alginate est un copolymère de polysaccharide linéaire α-L-guluronique acide (G) et β-D-mannuronique acide (M). Zones avec des monomères G répéter, appelé "G-blocs», sont inter-reliés pour former un hydrogel, en présence d'ions calcium divalents.

Figure 2b. (Bi) petits follicules encapsulée peu d'expérience dans la force de compression d'alginate au début de la culture. Cependant, comme le follicule se développe le volume déplacé dans le bourrelet est en augmentation, ce qui entraîne une plus grande force de compression dans la direction opposée de l'expansion du follicule (B-II).

Figure 2c. Les chaînes de polymères individuels sont complètement empêtré dans la solution de fibrine d'alginate avant la réticulation. Les deux composantes de la FA-IPN commencer à réticuler immédiatement, car ils sont exposés au mélange de la thrombine et du calcium.

Figure 3a. Organigramme pour l'isolement du follicule et l'encapsulation dans un FA-IPN. Follicules secondaires sont isolés à partir d'une souris de 16 jours anciens (Ai). Les organes reproducteurs sont disséqués (A-II), et les follicules isolés sont transférés dans un plat avec les médias de maintenance (A-III).

Figure 3b La méthode de la goutte pour l'encapsulation des follicules en solution d'alginate fibrinogène (B: I-IV).. Deux gouttes de solution de fibrinogène alginate, la baisse de rinçage (10 pi) et la baisse de l'encapsulation (90 ul) sont pipetés dans le plat (Bi). Suivant 3-5 follicules sont transférés à une baisse de rinçage (B-ii). Après rinçage et enlèvement des médias, les follicules sont transférés à la baisse de l'encapsulation (B-III). Chaque follicule est aspiré avec 5 pi fibrinogène alginate solution avec un pourboire de 10 uL pipette, puis expulsé en thrombine / calcium solution (B-IV).

Figure 3c. Le réticule de perles pour 5 minutes. La méthode du parafilm pour l'encapsulation des follicules en solution d'alginate fibrinogène (C: I-III). Fibrinogène-alginate solution de (7,5 uL) est pipeté sur la diapositive parafilm verre enduit et les follicules sont transférées individuellement pour chaque goutte après rinçage (Ci, ii). La thrombine solution de (7,5 uL) est ajoutée à chaque goutte (C-III).

Figure 3d - e. Les gouttes sont recouvertes d'une seconde lame de verre enduits et parafilm la FA-IPN est réticulé dans l'incubateur pendant 5 minutes. (D) Les follicules encapsulés sont transférés à un milieu de croissance dans une plaque de 96 puits. (E) Une image d'un follicule encapsulé dans le FA-IPN (flèche blanche).

Figure 4. Dégradation de la fibrine par la croissance Follicle. Follicules dégrader la fibrine composante de la FA-IPN pendant la période de culture, ce qui est démontré par un cercle clair autour du follicule. Architecture 3D Le follicule est soutenu par l'alginate restant. Au jour 0 (J0), la fibrine est encore intacte et la matrice autour du follicule est trouble; après 1 jour dans la culture (D1) de l'anneau clair autour du follicule apparaît (flèche blanche) et le front de dégradation de la fibrine continue à étendre radialement le jour 2 (D2) et le jour 4 (D4) de la culture.

Figure 5. Images de la croissance folliculaire. Représentant images croissance folliculaire ofsecondary dans le FA-IPN au jour 0 (A), 4 (B), 6 (C) et 8 (D) de la culture. Après 8 jours, follicules antraux été mûri in vitro et les ovocytes résultant stade de MII sont affichés (E, le corps polaire est montré avec flèche noire).

Figure 6. Fibrine la dégradation a été inhibée par l'aprotinine. Growing follicules le jour 2, 4, 10 et 12 sont présentés dans la première rangée. L'aprotinine, à des concentrations 0,01 TIU / ml (deuxième rangée) et 0,1 TIU / ml a été ajouté aux milieux de culture aux jours 0, 2 et 4. Seuls les follicules des cultures avec 0,01 TIU / ml d'aprotinine la fibrine dégradée après l'enlèvement aprotinine et atteint le stade antral. Les follicules en culture dans 0,1 TIU / ml d'aprotinine ne poussent pas dans le FA-IPN.

Abréviation	Nom complet
Incubateur à CO 2	37 ° C incubateur avec 5% de CO 2
COC	Complexes ovocyte Cumulus
3D	3 dimensions
DM	Dissection des médias
EGF	Facteur de croissance épidermique
FA-IPN	Fibrine alginate réseau interpénétré
FBS	Sérum de veau fœtal
GM	Les milieux de croissance
GV	Vésicule germinale
hCG	La gonadotrophine chorionique humaine
SES	L'insuline transferrine Sélénium supplément
Vaisselle FIV	Centre ainsi de 60 mm dans le plat de la fécondation in vitro
MM	Entretien des médias
Ovocyte stade de MII	Métaphase ovocyte de stade II
rFSH	Hormone folliculaire Stimuler
SCT	Tris solution saline tamponnée
TIU	Trypsine unités inhibitrices

Tableau 1. Abréviations

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Discussion

La méthode présentée ovaire follicule encapsulation dans un FA-IPN permet la culture des follicules dans un environnement 3D in vitro. Un FA-IPN est une entreprise dynamique, réactive les cellules de matrice dans laquelle les propriétés mécaniques initiales sont déterminées par la combinaison des deux fibrine et d'alginate. Pendant la culture, le follicule encapsulé active protéases qui dégradent une seule composante de l'IPN, la fibrine, qui se traduit par une rigidité de gel diminue gradu...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fetuin	Sigma-Aldrich	F3385
FBS	Invitrogen	10082-139
Aprotinin	Roche Group	10236624001
CaCl2	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	039-00475	40 mM
EGF	Sigma-Aldrich	A412
rFSH	National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases
hCG	Sigma-Aldrich	CG-5
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	A1603
ITS	Sigma-Aldrich	I1884-1VL
L-15	GIBCO, by Life Technologies	11415
αMEM+Gluta MAX	GIBCO, by Life Technologies	32561
Pen-Strep	Cellgro	30-002-CI
TBS	Pierce, Thermo Scientific	28379
Tisseel Fibrin kit	Baxter Internationl Inc.	921030
Sodium Alginate	FMC BioPolymers	LF200DL	Mw 418kDa