שיטה Encapsulation השחלות זקיק ותרבות מערכת 3 מתכלה Proteolytically מימדי

Summary

שיטה חדשה אנקפסולציה השחלות זקיק ברשת 3D הפיברין-אלגינט interpenetrating מתואר. מערכת זו משלבת תמיכה מבנית עם השפלה פרוטאוליטי כדי לתמוך בפיתוח של זקיקים בשלים לייצר ביציות בוגרות. שיטה זו עשויה להיות מיושם אגרגטים תא התרבות לשמור תאים תאים מגעים ללא הגבלת ההתרחבות.

Abstract

זקיק בשחלה היא היחידה תפקודית של השחלה כי מפריש הורמוני המין ותומך הבשלת הביצית. בטכניקות זקיק במבחנה לספק כלי להתפתחות זקיק מודל כדי לחקור את הביולוגיה הבסיסית, והם עוד יותר מפותח כטכניקה לשימור פוריות מרפאה ^1-4. המערכת שלנו במבחנה תרבות מעסיקה הידרוג על מנת לחקות את הסביבה השחלות יליד ידי שמירה על ארכיטקטורת הזקיקים 3D, תאים תאים אינטראקציות איתות אוטוקריני כי התפתחות זקיק ישיר ^5. בעבר, היו זקיקים תרבותי בהצלחה אלגינט, פוליסכריד אינרטי אצות נגזר כי עובר gelation עם יוני סידן ^6-8. הידרוג אלגינט נוצר בריכוז של 0.25% w / v היו המתירני ביותר לתרבות זקיק, ושימר את יכולת ההתפתחות הגבוהה ביותר ^9. הידרוג אלגינט לא מתכלה, ובכך להגדיל את קוטר תוצאות זקיק בכוח דחיסה על זקיק אשר יכול להשפיע על הצמיחה זקיק ^10. לאחר מכן אנו פיתחה מערכת המבוססת על תרבות רשת הפיברין-אלגינט interpenetrating (FA-IPN), שבה תערובת של הפיברין וכן בג'ל אלגינט הם בעת ובעונה אחת. שילוב זה מספק סביבת מכני דינמי כי שני הרכיבים לתרום קשיחות מטריצה ​​בתחילה, אולם פרוטאזות מופרש על ידי הזקיק גדל לבזות הפיברין במטריצה ​​עוזב אלגינט רק כדי לספק תמיכה. עם מהמכון נמסר, התוכן אלגינט יכול להיות מופחת מתחת 0.25%, דבר שאינו אפשרי עם אלגינט לבד ^5. לכן, כפי הזקיק מתרחב, זה יהיה ניסיון כוח דחיסה מופחת עקב תוכן מוצקים מופחת. בזאת, אנו מתארים שיטה אנקפסולציה ומערכת במבחנה תרבות זקיקי השחלה בתוך FA-IPN. סביבת מכני דינמי מחקה את הסביבה הטבעית שבה השחלות זקיקים קטנים מתגוררים בקליפת נוקשה ולעבור לשד מתירני יותר כפי שהם גידול בגודל ^11. רכיב מתכלה עשוי להיות קריטי במיוחד עבור תרגום קליניים כדי לתמוך יותר מ 10 ⁶ פי הגידול בהיקף כי זקיקי אדם בדרך כלל עוברים in vivo.

Protocol

1. זקיק בידוד

ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי המכון הלאומי לבריאות מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה ועל שימוש בבעלי חיים הוקמה מוסדיים פרוטוקול טיפול באוניברסיטת Northwestern.

לקבלת תוצאות אופטימליות, והניתוחים כל מבוצעות L15 התקשורת לבקרת pH ברמות הסביבה של CO _2, על 37 מעלות צלזיוס בשלבים מחומם לבקרת טמפרטורה, על ספסל נקי כדי למזער את זיהום חיידקי. התקשורת דיסקציה (DM) מוכנה עם L15 התקשורת בתוספת פניצילין 50 IU / מ"ל ​​ו - 50 μL / mL סטרפטומיצין ו 1% FBS. התקשורת אחזקה (MM) מוכנה עם התקשורת αMEM בתוספת פניצילין 50 IU / מ"ל ​​ו - 50 μL / mL סטרפטומיצין ו 1% FBS.

1. העברת השחלות גזור טרי מהעכבר הישן 16 יום לתוך צלחת פטרי 35 מ"מ חדש עם MM 1-2 מ"ל מכיל 0.1% ו collagenase DNase 0.1%. דגירה במשך 15 דקות בתוך באינקובטור ב 37 ° C ו 5% CO _2.
2. לאחר דגירה, לבצע פעולות כביסה כמה DM להסיר collagenase, ולאחר מכן להעביר צלחת פטרי 35 מ"מ עם DM טריים. בודד זקיקים מהשחלה ידי מצליף בעדינות (או חיתוך) זקיקי מן השחלה כולה באמצעות שתי מחטים מד 28 08/05 המצורפת מזרקים חד פעמיים. הסר כמו stroma האפשר מבלי לפגוע בשלמות של הזקיק. לנתח את זקיקי השחלה משני 20-40 דולר (130-150mm). זקיקים אלו יש בדרך כלל 2-3 שכבות של תאים סומטיים.
3. הוסף 1 מ"ל ל MM המרכזי גם של 60 מ"מ IVF (הפריה חוץ גופית), צלחת פטרי, ו 3 MM מ"ל אל הטבעת החיצונית. העברת זקיקי שלם עם טפטפת על הטבעת החיצונית של המנה IVF בקצרה לשטוף ולאחר מכן סלקטיבי להעביר אותם לתוך הבאר המרכזית (ראו 1.4). בחנות זו צלחת IVF בחממה.
4. אחרי הכל את זקיקי נאספים, צעד הבחירה נעשית תחת מיקרוסקופ עם הגדלה לנתח 5-8x. זקיקים בריאים בעלי מאפיינים מורפולוגיים הבאים:
   • 2-3 שכבות תאים סומטיים
   • 130-150 מ"מ
   • אין הפרדה בין הביצית לבין תאים סומטיים
   • שלם ועגול ביציות
     מעבירים את זקיקי בריא למרכז מנות IVF אנקפסולציה.

2. Encapsulation זקיק, שיטה 1 - "שיטת Drop"

1. הוסף 1 מ"ל של 50 IU / mL תרומבין ב TBS עם 40 מ"מ CaCl ₂ לאמצע גם המנה IVF. ההפשרה ולשמור מניות פיברינוגן (50 מ"ג / מ"ל ​​ב TBS) על קרח. תביאו את פיברינוגן לטמפרטורת החדר מיד לפני השימוש.
2. הכן את הפתרון פיברינוגן / אלגינט על ידי ערבוב 1x PBS, אלגינט 0.5% בפתרון PBS ו 50 מ"ג / מ"ל ​​פיברינוגן פתרון ביחס 02:01:01 ב צינור 1.7 microcentrifuge סטרילי מ"ל. הימנע מציגה בועות לתוך התמיסה. בעדינות מערבולת ספין למטה. הפתרון נראה מעונן מעט צריכים להיות מוכנים מיד לפני השימוש.
3. מניחים שתי טיפות של פיברינוגן / פתרון אלגינט בטבעת החיצונית של המאכל IVF: טיפה 90 μL אנקפסולציה ו טיפה 10 μL לרחצה. כדי להקטין התאדות, לכבות את החימום על הבמה מיקרוסקופ הניתוחים. 10-15 העברת זקיקי לתוך אגל 10 μL עם כמות מינימלית של התקשורת בתרבות (<5 μL) באמצעות 200 מיקרומטר micropipette קצה, לערבב במהירות. כל העברה של זקיקים לתוך אגל 90 μL עם כמות מינימלית של פתרון (<5 μL) מירידה הראשונה, ומערבבים.
4. במקביל לשאוב זקיק one ו 5 μL של פתרון פיברינוגן / אלגינט באמצעות טיפ 10 פיפטה μL, ולשחרר את הפתרון ⁺ תרומבין / Ca ² בצלחת IVF. חזור על שלב זה עד שכל הזקיקים כמוסות.
5. חוצה הקישור חרוזים 5-7 דקות בתמיסה ⁺ תרומבין / Ca ^2. החרוזים יהיו כהים כמו ג'לים הפיברין. העברת חרוזים לתוך צלחת פטרי MM המכיל, החל חרוזים כהה הראשון. דגירה את המנה עבור 15-30 דקות inthe חממה כדי לשטוף את תרומבין הנותרים.
6. העברת חרוזים לתוך צלחת 96 תרבות היטב המכיל 100 μL של התקשורת הצמיחה זקיק, ואת התמונה מיד. התקשורת צמיחה (GM) מוכנה עם התקשורת αMEM בתוספת 10 mIU / mL של FSH רקומביננטי, 3 מ"ג / מ"ל ​​של BSA, 1 מ"ג / מ"ל ​​של שור fetuin, 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​של אינסולין, 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​של transferrin, ו 5 ng / mL של סלניום.

3. Encapsulation זקיק, שיטה 2 - "שיטת Parafilm"

1. הכן את הפתרון פיברינוגן / אלגינט על ידי ערבוב פתרון אלגינט 0.5% ו 50 מ"ג / מ"ל ​​פיברינוגן פתרון ביחס של 1:1 בתוך צינור 1.7 microcentrifuge סטרילי מ"ל.
2. פיפטה 7.5 μL טיפות של תערובת פיברינוגן / אלגינט לשקופית parafilm מצופה זכוכית עם 3 מפרידי מ"מ. העברת 1 זקיק לתוך כל טיפה עם ומינימוםאני הסכום של התקשורת.
3. הוסף 7.5 μL של פתרון ⁺ תרומבין / Ca ² לעזוב כל אחד. ערבוב מיותר כי ג'ל הטפסים באופן כמעט מיידי.
4. מכסים את ג'ל עם שקופית parafilm second מצופי זכוכית, לשים את השקופיות במהופך צלחת פטרי 100 מ"מ, ולהעביר בחממה במשך 5 דקות.
5. העברת חרוזים לתוך צלחת פטרי המכילה MM, ולאחר מכן אל התרבות היטב כפי שתואר לעיל. אם החרוזים נדבקים זה לזה, אשר עקב cross-linking בין החרוזים, הם יכולים להיות מופרדים בעדינות עם מלקחיים.

4. זקיק הדמיה שנה Media

1. כל 2 ימים, הזקיקים בתרבית הם צילמו באמצעות מיקרוסקופ האור בקוטר זקיק נמדד עם תוכנה ImageJ.
2. כל 2 ימים, מחצית התקשורת צמיחה (50 μL) הוא הוחלף על ידי טרי, טרום equilibrated התקשורת הצמיחה.

5. זקיק השחזור מטריקס 3D ו ההבשלה הביצית חוץ גופית (IVM)

1. לאחר 8 ימים של תרבות, הידרוג מופיעים ברור בשל השפלה מוחלטת של הרכיב הפיברין, ו - זקיקי להרחיב בקוטר של 300-400 מיקרומטר. אלגינט שנותר הוא מושפל על ידי lyase-אלגינט, אנזים הצמחי ספציפית מדרדרת אלגינט ואינו משפיע על תאים חיים.
2. הסר מדיה צמיחה מבארות המכיל את חרוזים להוסיף 100 מ"ל של 10 IU / lyase אלגינט מ"ל αMEM. השאירו את הצלחת בחממה במשך 25-30 דקות.
3. הסר זקיקי מן החרוזים מומס עם טיפ בסוף בוטה. העברה הראשונה הטבעת החיצונית של המאכל IVF המכיל DM, ולאחר מכן למרכז היטב, גם המכיל DM לשטוף.
4. לאחר כביסה, העברת זקיקי אל החיצוני, הטבעת הפנימית ואז מנה IVF המכיל התקשורת התבגרות. בתקשורת התבגרות חוץ גופית (IVM) מורכב αMEM, FCS 10%, 1.5 IU / mL של hCG, ו 5 ng / mL של גורם הגדילה באפידרמיס (EGF)
5. העברה ל-CO ₂ באינקובטור במשך 15-16 שעות.
   בדוק את זקיקי להרחבת קומולוס תאים. כדי להסיר את התאים מן הביצית קומולוס, מוסיפים פתרון hyaluronidase לריכוז הסופי 0.1 מ"ג / מ"ל ​​ו דגירה בחממה במשך 2-3 דקות. השתמש micropipette 75 מ"מ עד קצה גזירה התאים קומולוס מן הביצית על ידי pipetting מעלה ומטה מספר פעמים. קביעת שלב ההבשלה של הביצית תחת אור או מיקרוסקופ לנתח. שלבי האפשר, מן הפחות הבשל ביותר, הן:
   • הידרדר. הביצית היא מפוצלת לשניים או יותר חתיכות.
   • שלפוחית ​​הבמה ז'רמינל (GV). הביצית לא לחדש את המיוזה בתגובה חשיפה hCG, אשר בא לידי ביטוי על ידי הנוכחות המתמשכת של גרעין הביצית (GV).
   • שלפוחית ​​התמוטטות ז'רמינל (GVBD). קרום הגרעין נעדר מן הביצית, אך אין כיום גוף הקוטב. לכן, הביצית היא עדיין המיוזה-I.
   • Metaphase-II הביצית נעצר (MII). הביצית התחדש המיוזה, והוא נעצר כעת metaphase-II. גוף קוטב צריך להיות גלוי אור או מיקרוסקופ לנתח. הביצית יישאר בבית MII אלא מופרית בניסויים מאוחר יותר.

6. נציג תוצאות:

אנו תיאר שיטה אנקפסולציה הרומן של זקיקים בשחלות ב FA-IPN עבור בתרבות חוץ גופית (איור 1). זקיקי השחלה מורכבת הביצית מוקפת בכמה שכבות של תאים סומטיים. תקשורת בין תאים סלולריים מרובים חיונית להתפתחות זקיק הביצית הבשלה בריאה. אנקפסולציה זקיק ב הידרוג 3D תומך הרחבה זקיק תוך שמירה על הארכיטקטורה של זקיק ^9,11,12. כאשר זקיקים להתפתח, נפח שלהם מתרחב אקספוננציאלית ואת ביולוגי encapsulating צריך לאפשר את זה בלי הרחבה ופיתוח של כוח דחיסה עיכוב. FA-IPN היא רשת בנוי משני חומרים טבעיים, שם הפיברין הוא מתכלה proteolytically ידי plasmin מופעל על ידי זקיק ו אלגינט הוא אינרטי מבחינה ביולוגית ¹³ (איור 2). במהלך הצמיחה זקיק, השפלה הפיברין מתחיל מקומי ליד הזקיק, וממשיך עד הפיברין מנוקה מכל הידרוג. המרכיב הלא מתכלה אלגינט, אשר נותרה בשלמותה במשך כל תקופת תרבות, תומך מבנה 3D של הידרוג.

הזקיקים היו מבודדים בשלב המשני של פיתוח (150-180 מיקרומטר קוטר) והרחיב עד 400 מיקרומטר בשלב antral הפיתוח הג'לים FA-IPN. עם גירוי hCG, זקיקי תרבותי יכול לעבור תא הרחבה קומולוס, וביציות ניתן לחדש את המיוזה וקידמה metaphase II להפריה. תוצאות אלו מרמזות כי השיטה אנקפסולציה ואת החומר encapsulating מותר תרבות זקיק והתבגרות מוצלחת במבחנה (איור 3).

הפיברין השפלה סביב encapsulזקיקי ated מתחיל ביום הראשון של תרבות הושלמה ביום 6. Aprotinin, מעכב plasmin מסיסים, יכול לשמש כדי לשנות השפלה הפיברין ולהרחיב שיפוע מכני בחומר encapsulating (איור 4). אם זקיקי הם עם תרבותי 0.01 TIU / mL aprotinin, הפיברין הוא איטי יותר מושפל מזה 4 הימים הראשונים. עם זאת, זקיקי עדיין יכול להתפתח לשלב antral וביציות להישאר כשיר כדי לחדש את המיוזה metaphase השנייה לאחר aprotinin removed.A הוא ריכוז גבוה של aprotinin (0.1 TIU / mL) מעכב באופן משמעותי השפלה הפיברין, נוקשות מטריצה ​​מונע התפשטות זקיק ואת תא סומטי הפלישה לתוך המטריצה ​​הוא ציין.

באיור 1. תרשים זרימה של התפתחות זקיק. זקיק בשחלה מורכב הביצית במיקום מרכזי מוקף שכבה אחת או יותר של תאים סומטיים, אשר תומכים בהתפתחות הביצית. כאשר זקיקים להתפתח משנית בשלב antral preovulatory, התאים הסומטיים הסובבים את הביצית להתרבות להבדיל, ואת הביצית גדל בגודל. התבגרות ב חוץ גופית (IVM) הוא השלב הסופי של התרבות זקיק, כאשר תאים סומטיים סמוך הביצית, כינה התאים קומולוס, להרחיב לאחר גירוי hCG, ואת הביצית קורות חיים המיוזה ומתקדם ל II metaphase (MII) שלב.

איור 2 א. אלגינט הפיברין ו-אלגינט לתרבות זקיק 3D במבחנה. (א) אלגינט הוא ביולוגי טבעי מתאים בתרבות זקיק במבחנה בשל gelation עדין שלה מאפיינים ביוכימיים, כגון גודל רשת, קשיחות לשליטה אדישות ביולוגיים. אלגינט הוא קופולימר פוליסכריד ליניארי של חומצת α-L-guluronic (G) וחומצה β-D-mannuronic (M). תחומי עם מונומרים G חוזרים, המכונה "G-חוסם", הם צולבים להקים הידרוג בנוכחות יוני סידן divalent.

איור 2b. (BI) זקיקים קטנים במארז ניסיון כוח דחיסה נמוך אלגינט בתחילת התרבות. עם זאת, כפי זקיק מרחיב את נפח העקורים חרוז גוברת, שתוצאתה כוח דחיסה גדול בכיוון ההפוך של התפשטות זקיק (ב-ii).

איור 2c. שרשראות של פולימרים בודדים הם הסתבכו לגמרי פתרון הפיברין-אלגינט לפני cross-linking. שני המרכיבים של FA-IPN להתחיל לחצות את הקישור מיד כפי שהם נחשפים לתערובת של תרומבין וסידן.

איור 3 א. תרשים זרימה עבור בידוד זקיק ו אנקפסולציה ב FA-IPN. זקיקים משניים מבודדים עכבר 16 יום הישן (AI). איברי הרבייה גזור (A-II), ו זקיקים מבודדים מועברים צלחת עם התקשורת תחזוקה (A-iii).

איור 3b השיטה ירידה אנקפסולציה זקיק בפתרון אלגינט פיברינוגן (B: I-IV).. שתי טיפות של תמיסת פיברינוגן, אלגינט, ירידה השטיפה (10 μL) והירידה אנקפסולציה (90 μL) הם pipetted לתוך התבשיל (BI). הבא 3-5 זקיקי מועברים ירידה שטיפה (B-II). אחרי שטיפה והסרה התקשורת, זקיקי מועברים הירידה אנקפסולציה (B-iii). זקיק כל aspirated עם פתרון 5 פיברינוגן-אלגינט μL עם טיפ 10 פיפטה μL ולאחר מכן גורשו לתוך תרומבין / סידן פתרון (B-IV).

איור 3c. Crosslinks חרוז במשך 5 דקות. השיטה parafilm אנקפסולציה זקיק בפתרון אלגינט פיברינוגן (C: I-III). פיברינוגן, אלגינט פתרון (7.5 μL) הוא pipetted בשקופית parafilm מצופה זכוכית זקיקי מועברים בנפרד כל טיפה אחרי שטיפה (Ci, ב). טרומבין פתרון (7.5 μL) מתווסף כל טיפה (C-iii).

איור 3D - ה טיפות מכוסים שקופית parafilm second זכוכית מצופה FA-IPN הוא crosslinked בחממה במשך 5 דקות. (ד) זקיקי במארז מועברים בתקשורת צמיחה צלחת 96-היטב. (ה) תמונה של זקיק הגלום FA-IPN (חץ לבן).

איור 4. הפיברין השפלה ידי folli גדלCLE. זקיקי לבזות את מרכיב הפיברין של FA-IPN בתקופת התרבות, אשר באה לידי ביטוי ברור במעגל סביב הזקיק. ארכיטקטורה 3D של זקיק נתמך על ידי אלגינט הנותר. ביום 0 (D0) הפיברין הוא עדיין שלם המטריצה ​​סביב זקיק הוא מעונן, לאחר יום 1 בתרבות (D1) את הטבעת ברור סביב זקיק מופיע (חץ לבן) ו הקדמי השפלה הפיברין ממשיך להרחיב רדיאלית ביום 2 (D2) יום 4 (D4) של התרבות.

איור 5. תמונות של צמיחה זקיק. ותמונות נציג צמיחה ofsecondary זקיק של FA-IPN ביום 0 (א), 4 (ב), 6 (ג) ו -8 (ד) של התרבות. לאחר 8 ימים, זקיקי antral היו התבגר במבחנה, בשלב ביציות כתוצאה MII מוצגים (E, גוף קוטבי מוצג עם חץ שחור).

איור 6. הפיברין השפלה היה עצור על ידי aprotinin. גידול זקיקי על 2 היום, 4, 10 ו - 12 מוצגים בשורה הראשונה. Aprotinin בריכוזים 0.01 TIU / mL (שורה שנייה) ו 0.1 TIU / mL נוספה התקשורת והתרבות על 0 ימים, 2 ו 4. רק זקיק תרבויות עם הפיברין 0.01 TIU / mL aprotinin מושפלת לאחר הסרת aprotinin והגיע שלב antral. זקיקי בתרבית 0.1 TIU / mL aprotinin לא גדל ב FA-IPN.

נוטריקון	שם מלא
CO 2 באינקובטור	37 ° C חממה עם 5% CO 2
COC	תלולית הביצית מורכבת
3D	ממדי 3
DM	Dissection התקשורת
EGF	גורם צמיחה עוריות
FA-IPN	הפיברין-אלגינט interpenetrating רשת
FBS	סרום שור עוברית
ג'נרל מוטורס	צמיחה התקשורת
GV	ז'רמינל שלפוחית
hCG	גונדוטרופין כוריוני אנושי
ITS	אינסולין transferrin תוסף סלניום
IVF צלחת	המרכז גם 60 מ"מ בצלחת הפריה חוץ גופית
MM	תחזוקה התקשורת
MII הביצית הבמה	Metaphase הביצית שלב II
rFSH	הורמון מגרה זקיקים רקומביננטי
TBS	טריס בופר סליין
TIU	טריפסין יחידות מעכבות

טבלה 1. קיצורים

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

זקיק הציגו השחלות אנקפסולציה השיטה FA-IPN מאפשר תרבות זקיק בסביבת 3D במבחנה. FA-IPN הוא דינאמי, תאים תגובה מטריצה ​​שבו תכונות מכניות הראשוני נקבעים על ידי שילוב של הפיברין והן אלגינט. במהלך התרבות, זקיק במארז מפעיל פרוטאזות כי לבזות רק מרכיב אחד של IPN, את הפיברין, שתוצ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fetuin	Sigma-Aldrich	F3385
FBS	Invitrogen	10082-139
Aprotinin	Roche Group	10236624001
CaCl2	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	039-00475	40 mM
EGF	Sigma-Aldrich	A412
rFSH	National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases
hCG	Sigma-Aldrich	CG-5
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	A1603
ITS	Sigma-Aldrich	I1884-1VL
L-15	GIBCO, by Life Technologies	11415
αMEM+Gluta MAX	GIBCO, by Life Technologies	32561
Pen-Strep	Cellgro	30-002-CI
TBS	Pierce, Thermo Scientific	28379
Tisseel Fibrin kit	Baxter Internationl Inc.	921030
Sodium Alginate	FMC BioPolymers	LF200DL	Mw 418kDa