Proteolytically 분해 3 차원 시스템에서 난소 대과의 캡슐화 및 문화에 대한 방법

요약

3D 섬유소 - 알지네이트요 interpenetrating 네트워크에 난소 대과의 캡슐에 대한 새로운 방법을 설명합니다. 이 시스템은 성숙 oocytes을 만들어 미숙 모공의 개발을 지원하기 위해 proteolytic 저하로 구조적 지원을 결합한 제품입니다. 이 방법은 확장을 제한하지 않고 세포 세포 접촉을 유지하기 위해 문화 셀 집계에 적용될 수 있습니다.

초록

난소 대과는 섹스 호르몬을 secretes 난소의 기능 단위이며, oocyte의 성숙을 지원합니다. 체외의 대과 기술의 기본적인 생물을 조사하기 위해 모델 대과 개발하는 도구를 제공하고, 추가로 다산을 보존하는 기술로 발전되고있다 클리닉 ^1-4. 우리의 체외 배양 시스템은, 세포 세포의 상호 작용 및 paracrine 신호 것을 직접 고치 개발 ⁵ 3D follicular 구조를 유지하여 기본 난소 환경을 모방하기 위해 hydrogels을 사용합니다. 이전 모공이 성공적으로 알지네이트요, 칼슘 이온 ^6-8로 겔화를 겪습 불활성 조류 파생 다당류에 교양되었습니다. 0.25 % W / V의 농도에서 형성된 알긴산의 hydrogels는 뿌리 문화에 가장 허용되었고, 최고의 개발 역량 ⁹ 유지. 알긴산의 hydrogels 따라서, 뿌리의 성장 ¹⁰ 영향을 줄 수 있습니다 뿌리 압축력에 뿌리 직경 결과에 증가 분해되지 않습니다. 우리는 이후 섬유소와 알지네이트요의 혼합물을 동시에 gelled있는 섬유소 - 알지네이트요 interpenetrating 네트워크 (FA - IPN)을 기반으로하는 문화 시스템을 개발했습니다. 두 구성 요소가 처음 매트릭스 강성에 기여하기 때문에이 조합은 역동적인 기계 환경을 제공하지만, 성장 뿌리에 의해 분비 프로 테아제 지원을 제공하기 위해서만 알지네이트요를 떠나 매트릭스의 섬유소를 저하. IPN으로 알지네이트요 내용은 혼자 ⁵ 알지네이트요 가능하지 않습니다 0.25 %, 아래 줄일 수있다. 따라서 뿌리가 확장되면, 그것은 감​​소 고체 내용으로 인해 감소 압축 힘을 경험하게 될 것입니다. 여기에, 우리는 캡슐화 방법 및 FA - IPN 이내에 난소의 모공에 대한의 체외 배양 시스템을 설명합니다. 동적 기계적 환경은 작은 모공이 단단한 피질에 거주하고 크기가 ¹¹ 증가로 더 허용 모수로 이동하는 자연 난소 환경을 모방한 것이었 지요. 분해 구성 요소는 인간의 머리카락은 정상적으로 생체내에서 받아야 해당 볼륨에있는보다 큰 10 ⁶ 배 증가를 지원하기 위해 임상 번역에 특히 중요있을 수 있습니다.

프로토콜

1. 소낭 절연

동물 실험은 노스웨스턴 대학에서 지침과 규정을 건강 가이드의 국립 연구소에 의해 규정된 실험실 동물의 관리 및 사용과 설립 기관 동물 사용 및 관리 프로토콜에 따라 수행되었다.

최적의 결과를 들어, 모든 해부는 세균 오염을 최소화하기 위해 37 °의 온도 제어를위한 C 가열 단계, 그리고 깨끗한 벤치에, CO _2의 주위 수준에서 산도 컨트롤에 대한 L15 미디어 실시하고 있습니다. 해부 미디어 (DM)는 50 IU / ML 페니실린 50 ML / μL 스트렙토 마이신, 1 % FBS와 보충 L15 매체와 준비가되어 있습니다. 유지 보수 미디어 (MM)는 50 IU / ML 페니실린 50 ML / μL 스트렙토 마이신, 1 % FBS와 보충 αMEM 매체와 준비가되어 있습니다.

1. 0.1 % Collagenase와 0.1 % DNase를 포함 1-2 ML의 MM 가진 새로운 35mm 페트리 접시에 16일 오래된 마우스 갓 해부 난소를 전송합니다. 37 ° C와 5% CO ₂ 배양기 안에서 15 분 동안 품어.
2. 부화 후 collagenase를 제거한 다음 새로운 DM과​​ 35mm 페트리 접시에 전송하는 DM 몇 가지 세척 단계를 수행합니다. 부드럽게 일회용 주사기에 연결된이 28 8분의 5 게이지 바늘을 사용하여 전체 난소에서 (또는 절삭) 모공 거리 flicking하여 난소에서 모공 분리. 뿌리의 무결성을 손상하지 않고 가능한 한 많은 기질로 제거합니다. 난소 당 20-40 보조 모공 (130~150mm)을 해부하다. 이러한 모공은 보통 체세포로부터 2-3 레이어를했습니다.
3. 60mm IVF (체외 수정을)를 페트리 접시 및 외륜 3 ML의 MM 잘 중앙 1 ML의 MM을 추가합니다. 간단히 린스로 IVF 요리의 외륜에 피펫과 함께 그대로 모공을 전송하고, 다음 선택 (1.4 참조) 중앙에 잘 그들을 전송합니다. 인큐베이터에서 IVF 요리를 저장합니다.
4. 모든 모공이 수집된 후 선택 단계는 5 배속 배율과 해부 현미경으로 수행됩니다. 건강한 머리카락은 다음과 형태학의 특성을 가지고 :
   • 2-3 체세포 레이어
   • 130~150mm
   • oocyte와 체세포 사이에 분리도
   • 온전하고 라운드 oocytes
     캡슐화위한 IVF 요리의 중심지로 건강한 모공을 전송합니다.

2. 뿌리의 캡슐화, 방법 1 - "드롭 방법"

1. 중간에 잘 IVF 요리의 40 MM CaCl ₂ TBS에서 50 IU / ML 트롬빈 1 ML을 추가합니다. 해동 얼음에 피브리노겐 주식 (TBS에서 50 MG / ML)를 유지. 바로 사용하기 전에 실온에 섬유소를 가져와.
2. 혼합 1X PBS, 0.5 % PBS 솔루션 알지네이트요 50 1.7 ML 살균 microcentrifuge 관에서 2시 1분 1초 비율 MG / ML의 피브리노겐 솔루션 피브리노겐 / 알지네이트요 솔루션을 준비합니다. 솔루션에 거품을 도입하지 마십시오. 부드럽게 와동과 스핀 다운. 이 솔루션은 약간 뿌연 나타나고 사용하기 전에 바로 준비를해야합니다.
3. 플레이스 피브리노겐 / IVF 요리의 외륜의 알지네이트요 솔루션의 두 방울 : 캡슐화 및 세탁 10 μL 비말을위한 90 μL 소적. 증발을 감소하려면, 해부 현미경에서 가열 단계를 끄십시오. 200 μm의의 micropipette 팁, 그리고 신속하게 믹스를 사용하여 문화 미디어 (<5 μL)의 최소 금액과 함께 10 μL 비말로 전송 10-15 모공. 최소한 첫 번째 드롭에서 솔루션의 금액 (<5 μL)와 혼합과 90 μL 비말로 머리카락을 모두 전송합니다.
4. 동시에 한 뿌리와 IVF 요리에 트롬빈 / CA ^{2 +} 용액에 10 μL 피펫 팁, 그리고 릴리스를 사용하는 피브리노겐 / 알지네이트요 솔루션의 5 μL를 대기음. 모든 모공이 캡슐 때까지이 단계를 반복합니다.
5. 크로스 링크 트롬빈 / CA ^{2 +} 솔루션 5-7분위한 비즈. 구슬은 섬유소의 젤로 어두운 될 것입니다. 먼저 어두운 비즈로 시작, 페트리 접시 포함 MM에 비즈를 전송합니다. 남은 트롬빈을 씻어하는 15-30분 기계가 보육을 위해 요리를 품다.
6. 즉시 100 대과 성장 미디어 μL 및 이미지를 포함하는 96 잘 문화 판에 구슬을 전송합니다. 성장 미디어 (GM)이 재조합 FSH 10 mIU / ML, BSA 3 MG / ML로 보충 αMEM 미디어와 함께 준비 1 MG / 소 fetuin 5 인슐린 μg / ML, 5 μg / 트랜스페린의 ML의 ML, 5 NG / 셀레늄의 ML.

3. 뿌리의 캡슐화, 방법 2 - "Parafilm 방법"

1. 1.7 ML 살균 microcentrifuge 관에서 1:1 비율로 0.5 % 알지네이트요 솔루션 50 MG / ML의 피브리노겐 솔루션을 혼합하여 피브리노겐 / 알지네이트요 솔루션을 준비합니다.
2. 3mm 스페이서와 parafilm 코팅 유리 슬라이드에 피브리노겐 / 알지네이트요 혼합물의 피펫 7.5 μL 방울. minima 각 드롭에 한 뿌리를 전송미디어 내 금액입니다.
3. 각 드롭 트롬빈 / CA ^{2 +} 솔루션의 7.5 μL를 추가합니다. 젤 거의 즉시 양식 때문에 혼합이 불필요합니다.
4. 두 번째 parafilm 코팅 유리 슬라이드로 젤 커버, 100mm 페트리 접시에 거꾸로 슬라이드를 넣고 5 분 동안 인큐베이터에 전송할 수 있습니다.
5. MM을 포함하는 페트리 접시에 비즈를 전송하고, 다음뿐만 아니라 이전에 설명한 문화에. 비즈가 함께 붙어 있으면, 어떤은 비즈 사이의 상호 연결로 인해, 그들은 부드럽게 포셉로 구분하실 수 있습니다.

4. 뿌리의 이미징 및 미디어 변경

1. 매 2 일, 교양 모공은 가벼운 현미경과 뿌리 직경이 소프트웨어 프로그램 ImageJ로 측정을 사용하여 몇 군데 있습니다.
2. 매 2 일, 성장 미디어 (50 μL)의 절반은 신선한 사전 equilibrated 성장 미디어로 대체됩니다.

5. 3D 매트릭스로부터 체외의 Oocyte의 성숙에 뿌리 복구 (IVM)

1. 문화 8 일 후에, hydrogels 분명 섬유소 구성 요소의 저하를 완료로 인해 나타납니다, 그리고 모공은 300-400 μm의의 직경을 확장합니다. 나머지 알지네이트요은 알지네이트요 - lyase, 특히 알지네이트요를 저하와 동물 세포에 영향을주지 않는 식물 유래 효소에 의해 저하됩니다.
2. 구슬이 들어있는 우물에서 성장 미디어를 제거하고 10 IU / αMEM의 ML 알지네이트요의 lyase 100 ML를 추가합니다. 25~30분위한 인큐베이터에있는 접시를 남겨주세요.
3. 뭉툭한 끝 끝으로 해산 비즈에서 머리카락을 제거합니다. DM을 포함 IVF 요리의 외륜 먼저 전송하고 잘 센터에도 씻어 DM 포함.
4. 세척 후, 바깥쪽으로 모공을 전송하고, 성숙 미디어를 포함하는 IVF 요리의 다음 내부 고리. 체외의 성숙 미디어에서 (IVM) αMEM 10 % FCS, hCG 1.5 IU / ML로 구성되어 있으며, 5 NG / ML 표피 성장 인자 (EGF)의
5. 15~16시간에 대한 CO ₂ 배양기로 전송합니다.
   큐뮬러스 세포 확장을위한 모공 검사합니다. , oocyte에서 적운 세포를 제거 최종 농도 hyaluronidase 솔루션을 추가 0.1 MG / ML 후 2-3 분 동안 인큐베이터에서 부화시오. 몇 시간을 아래와 pipetting하여 oocyte에서 전단 큐뮬러스 세포에 75mm의 micropipette 팁을 사용합니다. 가벼운 또는 해부 현미경 oocyte의 성숙 단계를 확인합니다. 가능한 단계는, 적어도 대부분의 성숙으로, 다음과 같습니다
   • 퇴화한. oocyte는 두 개 이상의 조각으로 조각화되어 있습니다.
   • 새싹 소포 (GV) 단계. oocyte는 oocyte (GV)의 핵의 지속적인 존재가 분명 hCG 노출에 대한 응답으로 감수 분열이 재개되지 않았다.
   • 새싹 소포 분석 (GVBD). 핵 막에는 oocyte 결석은 아니지만 북극 ​​바디 선물이 없습니다. 따라서 oocyte는 감수 분열 - 난 아직이다.
   • Metaphase - II 체포 oocyte (미이). oocyte는 감수 분열을 재개하고, 지금은 metaphase - II에 체포됩니다. 극지 몸은 가벼운 또는 해부 현미경에서 볼 수 있습니다. 나중에 실험에서 수정된 않는 oocyte는 미이에서 유지됩니다.

6. 대표 결과 :

우리는 (그림 1) 체외 문화에 대한 FA - IPN의 난소 모공의 소설 캡슐 방법을 설명했다. 난소의 모공은 체세포의 여러 레이어로 둘러싸인 oocyte로 이루어져 있습니다. 여러 세포 구획 간의 통신은 건강한 뿌리 개발 및 oocyte의 성숙을 위해 필수적입니다. 뿌리 ^9,11,12의 구조를 유지하면서 3D 히드로겔에서 뿌리의 캡슐은 대과 확장을 지원합니다. 모공이 개발로 그들의 볼륨이 기하 급수적으로 확장되고 캡슐 biomaterial은 억제 압축력의 발전없이 확장을 허용한다. FA - IPN은 섬유소는 뿌리에 의해 활성화되고 알지네이트요는 (그림 2) ¹³ 생물 학적 불활성이다 plasmin에 의해 분해됩니다 proteolytically이 천연 소재의 내장 네트워크입니다. 뿌리 성장하는 동안, 섬유소 저하는 뿌리 근처에 로컬 시작, 그리고 섬유소가 히드로겔에서 해결이 될 때까지 계속됩니다. 문화 시대에 걸쳐 그대로 남아 아닌 분해 알지네이트요 구성 요소, 히드로겔의 3D 구조를 지원합니다.

모공은 개발의 보조 무대 (150-180 μm의 직경)에 고립과 FA - IPN의 젤의 개발의 antral 단계에서 400 μm의 확대했다. hCG 자극과 함께, 교양 모공이 큐뮬러스 셀 확장을 받아야 수 있으며, oocytes는 수정을 위해 metaphase II에 감수 분열과 발전을 재개할 수 있습니다. 이러한 결과는 캡슐화 방법 및 캡슐 소재가 체외 (그림 3)의 뿌리 문화와 성공적인 성숙을 허용하는 것이 좋습니다.

encapsul 주위 섬유소 저하ated 모공은 문화의 첫날에 시작 일 6 완료됩니다. Aprotinin, 가용성 plasmin 억제제는 섬유소 저하를 변경하고 캡슐 소재 (그림 4)에서 기계 그라디언트를 확장하는 데 사용할 수 있습니다. 모공이 0.01 TIU / ML aprotinin과 교양 경우, 섬유소는 첫 번째 4 일간 저하 느립니다. 그럼에도 불구하고, 모공은 여전히​​ antral 단계 개발하고 oocytes는 aprotinin이 aprotinin의 removed.A 높은 농도 (0.1 TIU / ML) 후 metaphase II에 감수 분열을 재개하는 능력이 남아 크게 섬유소 저하를 억제, 매트릭스 강성은​​ 대과 확장 및 체세포를 방지 매트릭스에 침공을 준수합니다.

그림 1. 대과 개발의 흐름도. 난소 대과는 oocyte 개발을 지원 체세포 하나 이상의 레이어로 둘러싸인 중앙에 위치한 oocyte로 구성되어 있습니다. 모공이 preovulatory antral 무대 차에서 개발할 때, oocyte를 둘러싼 체세포는 때 체세포가 인접, 분아 따위에 의해 번식과 차별, 그리고 oocyte의 크기가 증가합니다. 체외의 성숙에 (IVM) 뿌리 문화의 최종 단계입니다 oocyte는 적운 세포를 칭했다, hCG 자극 후 확장하고 oocyte는 감수 분열을 다시 시작하고 metaphase II (미이) 단계로 진행.

그림 2A. 체외에서 3D 뿌리 문화에 대한 알긴산과 섬유소 - 알지네이트요가. () 알긴산은 부드러운 겔화 및 메쉬의 크기, 제어 강성 및 생물 학적 자동 력이 없음으로 생화학 특성으로 인해 체외의 뿌리 문화에 적합한 자연 biomaterial입니다. 알긴산은 α​​ - L - guluronic 수 소산​​ (G)와 β - D - mannuronic 수 소산​​ (M)의 선형 다당류의 공중 합체입니다. 반복 G의 단량체와 영역, "G - 블록"칭했다, 이가의 칼슘 이온의 존재에 히드로겔를 형성하기 위해 상호 연결되어 있습니다.

그림 2B. (BI)는 작은 캡슐 모공은 문화의 시작 알지네이트요의 낮은 압축력 경험을 할 수 있습니다. 그러나 뿌리는 비드의 갑작스런 볼륨을 확장으로 대과 확장의 반대 방향 (B - II)에 큰 압축력 결과 이​​는 증가하고 있습니다.

그림 2C. 각각의 고분자 사슬 전에 상호 링크로 섬유소 - 알지네이트요 솔루션 완전히 얽혀 버린 있습니다. FA - IPN의 두 구성 요소는 그들이 트롬빈과 칼슘의 혼합물에 노출 있으므로 즉시 상호 링크를 시작합니다.

그림 3A. FA - IPN. 중고등 머리카락의 뿌리 절연 및 캡슐에 대한 흐름도는 16 일 옛 마우스 (AI)에서 격리됩니다. 생식기는 (A - II)를 해부하고 있으며, 절연 모공은 유지 보수 매체 (A - 3)와 함께 접시에 전송됩니다.

그림 3B 피브리노겐 알지네이트요 솔루션 뿌리의 캡슐에 대한 드롭 방식 (B : I - IV).. 피브리노겐 - 알지네이트요 솔루션의 두 방울, rinsing 드롭 (10 μL)와 캡슐 드롭 (90 μL)이 요리 (BI)에 pipetted 수 있습니다. 앞으로 3-5 모공은 rinsing 드롭 (B - II)으로 전송됩니다. rinsing 및 미디어 제거 후 모공이 캡슐 드롭 (B - 3)으로 전송됩니다. 각각의 뿌리는 10 μL 피펫 팁 5 μL 피브리노겐 - 알지네이트요 솔루션 aspirated 후 트롬빈 / 칼슘 솔루션 (B - IV)에 퇴학입니다.

그림 3C. 5 분 구슬 crosslinks. 피브리노겐 알지네이트요 솔루션 뿌리의 캡슐에 대한 parafilm 방법 (C : I - III). 피브리노겐 - 알지네이트요 솔루션 (7.5 μL)는 parafilm 코팅 유리 슬라이드에 pipetted이며 (CI, II) rinsing 후 모공은 각 드롭에 개별적으로 전송됩니다. 트롬빈 용액 (7.5 μL)가 각 드롭 (C - 3)에 추가됩니다.

그림 3D - E. 방울 두 번째 parafilm 코팅 유리 슬라이드 덮여 있으며 FA - IPN은 5 분 동안 인큐베이터에서 가교입니다. (D) 캡슐 모공은 96 - 웰 플레이트 성장 미디어에 전송됩니다. (E) FA - IPN (흰색 화살표)에 캡슐 대과의 이미지.

그림 4. 성장 folli에 의해 섬유소 저하끌레. 모공은 뿌리 주위 클리어 서클에 의해 입증되는 문화 기간 동안 FA - IPN의 섬유소 구성 요소를 저하. 뿌리의 3D 아키텍처는 남아있는 알지네이트요에 의해 지원됩니다. 하루에 0 (D0) 섬유소는 여전히 그대로이며, 뿌리 주위 매트릭스가 흐린이며 문화의 일일 (D1) 뿌리 주변의 맑은 반지가 나타납니다 (흰색 화살표)과 섬유소 저하 프런트는 반경 하루에 확장을 계속하고 후 2 (D2)와 문화의 일 4 (D4).

그림 5. 뿌리 성장의 이미지. 일 0에 FA - IPN의 대표 이미지 ofsecondary 뿌리의 성장 (A), 4 (B), 6 (C) 문화 8 (D). 팔일 후에 antral 모공은 체외에서 성숙되었고, 결과 미이 스테이지 oocytes는 (E, 북극 시체가 검정색 화살표로 표시됩니다) 표시됩니다.

그림 6. 섬유소 저하는 aprotinin에 의해 저해되었다. 일 2, 4, 10, 12 모공 성장은 첫 번째 행에 표시됩니다. Aprotinin 농도에서 0.01는 TIU / ML (두 번째 행)와 0.1 TIU / ML은 일 0, 2, 4 문화 미디어에 추가되었습니다. 단 aprotinin 제거 후 0.01 TIU / ML aprotinin 저하 섬유소와 문화를 뿌리 및 antral 단계에 도달했습니다. 0.1에서 교양 모공이 TIU / ML aprotinin은 FA - IPN에서 성장하지 않았다.

약어	전체 이름
CO 2 인큐베이터	37 5% CO 2 ° C 배양기
COC	큐뮬러스 oocyte 복합
3D	차원 3
DM	해부 미디어
EGF	표피 성장 인자
FA - IPN	섬유소 - 알지네이트요 interpenetrating 네트워크
FBS	태아 소 혈청
GM	성장 미디어
GV	새싹 소포
hCG	인간 chorionic 생식 샘 자극 호르몬
ITS	인슐린 트랜스페린 셀레늄 보충
IVF 요리	잘 센터 체외 수정을 접시에 60mm
MM	유지 보수 매체
미이 스테이지 oocyte	Metaphase II 스테이지 oocyte
rFSH	재조합 Follicular 자극 호르몬
TBS	트리스는 호수 버퍼
TIU	트립신 억제 단위

표 1. 약어

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토론

FA - IPN의 표시 난소 대과의 캡슐 방법은 체외에서 3D 환경에서 뿌리 문화를 수 있습니다. FA - IPN은 초기 기계적 특성이 섬유소와 알지네이트요 모두의 조합에 의해 결정하는 동적 셀 응답 매트릭스입니다. 문화 동안 캡슐 대과은 전적으로 문화의 끝에 남은 알지네이트요에 의해 공헌하는 점차 감소 젤 강성 결과 IPN의 한 구성 요소, 섬유소를 저하 프로 테아제을 활성화한다. FA - IPN로 얻은 동...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fetuin	Sigma-Aldrich	F3385
FBS	Invitrogen	10082-139
Aprotinin	Roche Group	10236624001
CaCl2	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	039-00475	40 mM
EGF	Sigma-Aldrich	A412
rFSH	National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases
hCG	Sigma-Aldrich	CG-5
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	A1603
ITS	Sigma-Aldrich	I1884-1VL
L-15	GIBCO, by Life Technologies	11415
αMEM+Gluta MAX	GIBCO, by Life Technologies	32561
Pen-Strep	Cellgro	30-002-CI
TBS	Pierce, Thermo Scientific	28379
Tisseel Fibrin kit	Baxter Internationl Inc.	921030
Sodium Alginate	FMC BioPolymers	LF200DL	Mw 418kDa