Inmovilización de bacterias para tratamiento de imágenes de microscopía de fuerza atómica

Resumen

Viven las bacterias Gram-negativas y Gram-positivas pueden ser inmovilizadas en gelatina mica recubierta y la imagen en el líquido utilizando microscopía de fuerza atómica (AFM).

Resumen

AFM es una de alta resolución (escala nm) herramienta de imagen que las sondas de una superficie mecánicamente. Tiene la capacidad de las células de la imagen y las biomoléculas, en un medio líquido, sin la necesidad de tratar químicamente la muestra. Con el fin de lograr este objetivo, la muestra suficientemente que se adhieren a la superficie de montaje para evitar la extracción de las fuerzas ejercidas por su punta de exploración AFM. En muchos casos, las imágenes éxito depende de la inmovilización de la muestra a la superficie de montaje. De manera óptima, la inmovilización debe ser mínimamente invasiva para la muestra de tal manera que los procesos metabólicos y los atributos funcionales que no están comprometidos. Por el recubrimiento de superficies mica recién abierto, con porcino (cerdo) de gelatina, las bacterias cargadas negativamente pueden ser inmovilizadas en la superficie y la imagen en un líquido por AFM. La inmovilización de las células bacterianas en gelatina mica recubierta es más probable debido a la interacción electrostática entre las bacterias cargadas negativamente y la gelatina con carga positiva. Hay varios factores que pueden interferir con la inmovilización de bacterias, incluyendo los componentes químicos del líquido en el que las bacterias de suspensión, el tiempo de incubación de la bacteria en las características de gelatina mica recubierta de superficie, de la cepa bacteriana y el medio en el que las bacterias son expuestas. En general, el uso de la mica recubierta de gelatina resulta ser de aplicación general para las células microbianas de imágenes.

Protocolo

1. Mica de preparación:

1. Cortar la mica (Microscopía Electrónica de Ciencias) con unas tijeras al tamaño necesario para ajustarse al microscopio AFM (aprox. 22 x 30 mm).
2. Cleave la mica de ambas partes, generalmente por medio de cinta para quitar la capa externa, hasta que sólo quedan las capas continua suave.

2. Preparación de la solución de gelatina:

1. Añadir 100 ml de agua destilada a una botella de laboratorio.
2. Calentar el biberón en el microondas hasta que el agua comience a hervir. (Si el microondas no está disponible, el agua se puede calentar en un vaso sobre un plato caliente.)
3. Pesar 0,5 gramos de la gelatina (Sigma G-6144, G 2625-G o 2500) y añadir el agua destilada caliente.
4. Haga girar suavemente la botella hasta que la gelatina se disuelva por completo.
5. Enfriar la solución de gelatina a 60-70 º C.
6. Vierta aproximadamente 15 ml en un vaso pequeño (20 ml) en el que se puede cortar la mica escindida de cruce.

3. Mica de recubrimiento:

1. Sumerja las plazas mica en la solución de gelatina caliente y retirar rápidamente de tal manera que la mica está cubierta (Fig. 1a).
2. Después del recubrimiento, el apoyo a la mica de inmediato, en la orilla, sobre una toalla de papel para secarse en el aire ambiente (fig. 1b). La mica recubierta de gelatina se puede utilizar por lo menos 2 semanas. El exceso de solución de gelatina se puede mantener refrigerada y usada por aproximadamente un mes, simplemente calentar la solución de reserva de entre 60-70 º C. Se debe tener cuidado para asegurar que la gelatina no se hierve durante el recalentamiento.

4. Montaje de las bacterias en la mica recubierta de gelatina:

1. Pellet 1 ml de un cultivo bacteriano (0,5 a 1,0 DO a 600 nm) de 800 a 4500 fcr. Dependiendo de la bacteria, el uso de la RCF mínimo que se sedimenten las células de ~ 5 minutos.
2. Lavar el sedimento en el mismo volumen de agua filtrada desionizada o tampón.
3. Recoger las células de nuevo por centrifugación.
4. Resuspender el precipitado con prontitud en 500 L de agua desionizada o tampón Nanopure. (La suspensión bacteriana deberá presentar una apariencia turbia con el fin de tener una concentración adecuada de las células de AFM de imágenes.)
5. Solicitar la suspensión de células (10-20 l) de la mica recubiertos de gelatina y se extendió sobre la superficie con una punta de la pipeta (Fig. 1c). Se debe tener cuidado de no contacto físico con la superficie de la gelatina con la punta de la pipeta, mientras que la aplicación o la difusión de la solución bacteriana.
6. Permita que la superficie en reposo durante 10 minutos y enjuagar con un chorro de agua o tampón (Fig. 1 cd). A lo largo del procedimiento, tener cuidado de asegurarse que la muestra no se deja secar.

5. Los resultados representativos:

La figura 2 muestra imágenes de ejemplo de las células bacterianas que se han montado en gelatina mica recubierta y fotografiada por la AFM. En nuestros laboratorios, las muestras suelen ser fotografiado usando un microscopio de fuerza atómica PicoPlus (Agilent Technologies, Temple, AZ) equipado con un cabezal de escaneado 100 micras. El instrumento es operado a 128-512 píxeles por línea de exploración a una velocidad de escaneo de líneas de 0,5-1,0 / s. Los voladizos que se suelen utilizar son Veeco sondas de nitruro de silicio (MLCT-AUHW, Veeco, Santa Barbara, CA) con las constantes de la primavera nominales que van desde 0,01 hasta 0,1 nN / nm.

Figura 1. Gelatina a una temperatura de 60-70 º C se coloca en un vaso de precipitados de 20 ml. Con un par de pinzas recién cortado plazas mica están totalmente inmersos en la gelatina (a) ha retirado y colocado en posición vertical sobre una toalla de papel apoyado en un bastidor de microcentrífuga (b). Una gota de la muestra bacteriana se coloca en la mica y se extendió con una punta de pipeta, tanto en el X e Y (c). Después de permitir que la muestra se incuba en la superficie de la mica por lo menos durante 10 minutos, enjuague la muestra en una corriente de agua destilada. Si la inmovilización trabajado usted podrá ver una mancha opaca en la mica, como se muestra en el panel de la derecha de (d). Si la inmovilización no funcionó obtendrá un pedazo de mica clara como en el panel de la izquierda. La mancha opaca en las escalas de mica a la concentración de la bacteria en la gota que se coloca en la mica de gelatina tratada.

Figura 2. AFM imágenes de E. coli. En el panel (a), las células se montan en gelatina mica recubierta y la imagen en 0.005 M de PBS. Por comparación, una imagen de las células bacterianas montados en gelatina-mica recubierta y la imagen en el aire se muestra en el panel (b). A pesar de los tabiques son claramente visibles en la imagen recogida en el líquido, mayor resolución, como lo indica la presencia de pili (panel de inserción (b)), se puede obtener en el aire.

Discusión

Hay varios factores que pueden afectar a las células microbianas y de montaje de imágenes por AFM. La gelatina que se utiliza para el recubrimiento de la mica es importante. Comerciales de gelatina está aislado de una serie de vertebrados, incluyendo peces, vacas y cerdos. El origen y el método de procesamiento de determinar la idoneidad de la gelatina para la inmovilización de bacterias. Numerosas fuentes y tipos de gelatina fueron evaluados para determinar su eficacia en las bacterias inmovilizar [1]. Los dos gel...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre	Empresa	Número de catálogo
Gelatina	Sigma, St. Louis, MO	G6144, G2625 o G2500
PicoPlus Microscopio de Fuerza Atómica	Agilent Technologies, Tempe, AZ
AFM voladizos	Veeco, Santa Barbara, CA	MLCT-AUHW