Atomik Kuvvet Mikroskopi Görüntüleme Bakteriyel İmmobilizasyon

Özet

Canlı Gram-negatif ve Gram-pozitif bakterilerin jelatin kaplı mika üzerinde hareketsiz ve Atomik Kuvvet Mikroskobu (AFM) kullanarak sıvı görüntülü olabilir.

Özet

AFM görüntüleme aracı mekanik problar bir yüzey, yüksek çözünürlüklü (nm ölçekli). Numunenin kimyasal tedavi etmek gerek kalmadan, sıvı bir ortamda, görüntü hücreleri ve biyomoleküllerin yeteneği vardır. Bu amacı gerçekleştirmek için, örnek tarama AFM konsol ucu tarafından uygulanan kuvvetler tarafından kaldırılmasını engellemek için yeterli montaj yüzeyine uygun olmalıdır. Birçok durumda, başarılı görüntüleme için örnek montaj yüzeyine immobilizasyonu bağlıdır. Optimal, immobilizasyon minimal invaziv metabolik süreçleri ve fonksiyonel özellikleri tehlikeye böyle örnek olmalıdır. Domuz (domuz) jelatin kaplama taze bölünmüş mika yüzeyleri, negatif yüklü bakterilerin yüzeye immobilize ve sıvı AFM tarafından görüntülenmiş. Jelatin kaplı mika bakteri hücrelerinin immobilizasyonu negatif yüklü bakteri ve pozitif yüklü jelatin arasında elektrostatik etkileşim nedeniyle büyük olasılıkla. Çeşitli faktörler, kimyasal bileşenler bakteri asılı olduğu, sıvı, bakteri görüntülü hangi bakteri suşu ve orta jelatin kaplı mika, yüzey özellikleri bakteri inkübasyon süresi de dahil olmak üzere bakteriyel immobilizasyon, müdahale edebilirsiniz. Genel olarak, jelatin kaplı mika kullanımı genellikle görüntüleme mikrobiyal hücreler için geçerli olmak üzere bulunur.

Protokol

1. Mika hazırlanması:

1. AFM mikroskobu (yaklaşık 22 × 30 mm) uyum için gerekli boyut makas ile mika (Elektron Mikroskobu Bilimleri) kesin.
2. Cleave, her iki tarafta mika, genellikle bant kullanarak, dış katmanı kaldırmak için sadece yumuşak kesintisiz katmanları kalmayıncaya kadar.

2. Jelatin solüsyonu hazırlanması:

1. Bir laboratuvar şişesi 100 ml distile su ekleyin.
2. Mikrodalga şişe su kaynamaya başlayana kadar ısıtın. (Mikrodalga mevcut değilse, sıcak bir plaka üzerinde bir beher su ısıtılır.)
3. 0.5 gram jelatin (Sigma G-6144, G-2625 ya da G-2500) tartılır ve sıcak distile su ekleyin.
4. Yavaşça girdap jelatin kadar şişe tamamen çözülür.
5. 60-70 ° C'ye kadar jelatin solüsyonu soğutun
6. Kesim bölünmüş mika batırılmış olabilir içine küçük bir beher (20 ml) yaklaşık 15 ml dökün.

3. Mika kaplama:

1. Batmak mika ısıtılmış jelatin çözüm içine kareler ve mika (Şekil 1a) kaplı olduğu gibi hızlı çekilme.
2. Kaplama sonra, (Şekil 1b), havadaki kuru bir kağıt havlu üzerine, kenarında, hemen mika destek. Jelatin kaplı mika, en az 2 hafta süreyle kullanılabilir. Aşırı jelatin solüsyonu buzdolabında saklanmalı ve sadece 60-70 ° C arasında stok solüsyonu tekrar ısıtmayı tarafından yaklaşık bir ay için kullanılan Jelatin yeniden ısıtırken sırasında haşlanmış olmadığından emin olmak için alınmalıdır.

4. Jelatin kaplı mika bakteri Montaj:

1. Pelet bakteri kültürü 1 ml (0.5 - 1.0 OD 600 nm) 800 4500 RCF. Bakteri bağlı olarak, minimum RCF pelet ~ 5 dakika içinde hücreler
2. Filtreli deiyonize su ya da tampon aynı hacimde pelet yıkayın.
3. Santrifüj yoluyla hücreler tekrar toplayın.
4. Nanopure deiyonize su ya da tampon 500 mcL derhal pelletini tekrar. (Bakteriyel süspansiyon AFM görüntüleme için hücrelerin yeterli bir konsantrasyon elde etmek için gözle görülür bir şekilde bulanık olması gerekir.)
5. Bir pipet ucu (Şekil 1c) kullanarak yüzey üzerinde jelatin kaplı mika ve yayılması için hücre süspansiyonu (10-20 mcL) uygulayın. Bakım bakteriyel bir çözüm uygulayarak veya yayarken fiziksel pipet ile jelatin yüzeyine dokunmayın değil alınmalıdır.
6. İzin yüzeyi, 10 dakika dinlenme ve su ya da tampon (Şekil 1 cd) bir dere ile durulayın. Prosedürü boyunca, örnek kurumasına izin olmadığından emin olmak için özen gösterin.

5. Temsilcisi Sonuçlar:

Şekil 2, jelatin kaplı mika üzerine monte edilmiş ve AFM tarafından görüntülendi bakteri hücreleri örnek görüntüleri gösterir. Bizim laboratuvarlarımızda, örnekler, genellikle 100 mm tarama kafası ile donatılmış bir PicoPlus atomik kuvvet mikroskobu (Agilent Technologies, Tapınağı, AZ) kullanarak görüntülü. Cihaz bir tarama 0.5-1.0 satır / s hızda, line-scan başına 128-512 piksel işletilmektedir Tipik olarak kullanılan konsol Veeco 0.01 'den 0.1 nN / nm arasında değişen nominal yay sabitleri ile silisyum nitrür probları (MLCT-AUHW Veeco, Santa Barbara, CA).

Şekil 1: 60-70 ° C 20 ml beher yerleştirilen bir sıcaklık az jelatin . Bir cımbız kullanarak taze mika kareler tamamen jelatin (a) çekilmiş ve bir mikro santrifüj raf (b) yaslanmış bir kağıt havlu üzerine dik olarak yerleştirilen içine dalmış olan bölünmüş. Bakteriyel örnek bir damlacık X ve Y yönlerinde (c) hem de bir pipetlemeyin ucu ile mika ve yayılması üzerine yerleştirilir. Örnek mika yüzey üzerinde en az 10 dakika süreyle inkübe izin sonra distile su akışı örnek durulayın. Immobilizasyon çalıştı Eğer, (d) sağ panelinde görüldüğü gibi mika opak bir yerde görmek mümkün olacak. Immobilizasyon işe yaramadıysa sol paneldeki gibi net bir mika parçası alacak. Damlacık bakteri konsantrasyonu mika ölçeklerde opak nokta jelatin işlenmiş mika yerinde.

Şekil 2 E. AFM görüntüleri coli. Panel (a), hücreler, jelatin kaplı mika üzerine monte edilir ve görüntülü olarak 0.005 M PBS. Karşılaştırma için, jelatin kaplı mika üzerine monte edilmiş ve hava görüntülü bakteri hücrelerinin bir görüntü paneli (b) 'de gösterilmiştir. Septa pili (inset panel (b)) varlığı ile gösterildiği gibi sıvı, daha fazla çözünürlük, toplanan görüntü açıkça görülebilir hava elde edilebilir. Rağmen

Tartışmalar

Çeşitli faktörler AFM tarafından mikrobiyal montaj hücre ve görüntüleme etkileyebilir. Mika kaplama için kullanılan jelatin önemlidir. Ticari jelatin, balık, inek, ve domuz da dahil olmak üzere bir dizi omurgalıların izole edilmiştir. Kökeni ve işleme yöntemi Her iki bakteri immobilizasyon için jelatin uygunluğunu belirler. Sayısız kaynakları ve türleri jelatin hareketsizleştirir bakteri onların etkinliği değerlendirilmiştir [1]. Sigma G-6144, G-2625 için en etkili jelatin bulundu. Domuz (...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isim	Şirket	Katalog numarası
Jelâtin	Sigma, St Louis, MO	G6144, G2625 ve G2500
PicoPlus Atomik Kuvvet Mikroskobu	Agilent Technologies, Tempe, AZ
AFM Çıkma	Veeco, Santa Barbara, CA	MLCT-AUHW