Immobilization חיידקית עבור הדמיה על ידי מיקרוסקופית כוח אטומי

Summary

חיים חיידקים גראם שליליים גראם חיוביים יכולים להיות משותקת על מיקה ג'לטין מצופה הדמיה בנוזל באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM).

Abstract

AFM הינה ברזולוציה גבוהה (בסולם ננומטר) כלי הדמיה כי מכנית בדיקות משטח. יש לו את היכולת תאים התמונה ביומולקולות, בסביבה נוזלית, ללא צורך כימית לטפל המדגם. כדי להשיג מטרה זו, המדגם חייב דיו לדבוק פני השטח גובר על מנת למנוע הסרה של כוחות המופעלים על ידי קצה שלוחה סריקה AFM. במקרים רבים, הדמיה מוצלח תלוי immobilization של המדגם על פני השטח גובר. באופן אופטימלי, צריך להיות immobilization פולשנית כדי לדגום את כזה תהליכים מטבוליים ותכונות פונקציונליות אינם בסכנה. עד ביקע טרי ציפוי משטחים מיקה עם חזירי (חזיר) ג'לטין, חיידקים בעלי מטען שלילי יכול להיות משותקת על פני השטח הדמיה בנוזל על ידי AFM. Immobilization של תאים חיידקיים על מיקה ג'לטין מצופה קרוב לוודאי בשל אינטראקציה אלקטרוסטטית בין חיידקים בעלי מטען שלילי ואת הג'לטין מטען חשמלי חיובי. מספר גורמים יכולים להפריע immobilization חיידקים, כולל מרכיבים כימיים של הנוזל שבו חיידקים מושעים, זמן הדגירה של החיידק על ג'לטין מצופה, נציץ תכונות פני השטח של זן חיידקים המדיום שבו הם צילמו את החיידקים. באופן כללי, השימוש מיקה ג'לטין מצופה יימצא החלים בדרך כלל תאים מיקרוביאליים הדמיה.

Protocol

1. מיכה הכנה:

1. חותכים את מיקה (מדעי אלקטרונים מיקרוסקופית) עם מספריים לגודל הדרוש כדי להתאים את מיקרוסקופ AFM (בערך 22 × 30 מ"מ).
2. קליב מיקה בשני הצדדים, בדרך כלל באמצעות קלטת כדי להסיר את השכבה החיצונית, עד שרק שכבות רצוף וחלק נשארים.

2. הכנת פתרון ג'לטין:

1. מוסיפים 100 מ"ל מים מזוקקים כדי בקבוק מעבדה.
2. מחממים את הבקבוק במיקרוגל עד שהמים מתחילים לרתוח. (אם במיקרוגל אינו זמין, המים ניתן לחמם בכוס על פלטה חשמלית).
3. לשקול את 0.5 גרם של ג'לטין (Sigma-G-6144, G-2625 או G-2500), ולהוסיף למים מזוקקים חמים.
4. מערבולת הבקבוק בעדינות עד הג'לטין נמס לחלוטין.
5. מגניב הפתרון ג'לטין על 60-70 ° C.
6. יוצקים כ 15 מ"ל לתוך כוס קטנה (20 מ"ל) שלתוכו מיקה לחתוך ביקע יכול להיות טבול.

3. מיכה ציפוי:

1. להטביע את הריבועים נציץ לתוך הפתרון ג'לטין חימם ולסגת כזה מהר כי מיקה היא מצופה (איור 1 א).
2. לאחר ציפוי, לתמוך מיקה מיד, על קצה, על מגבת נייר לייבוש באוויר הסביבה (איור 1b). נציץ מצופה ג'לטין יכול לשמש לפחות 2 שבועות. הפתרון ג'לטין עודף יכולים להישמר בקירור בשימוש במשך חודש בערך, פשוט על ידי reheating הפתרון המניות בין 60-70 ° C. יש להקפיד על מנת להבטיח כי ג'לטין אינו מבושל במהלך reheating.

4. הרכבה חיידקים על נציץ מצופה ג'לטין:

1. גלולה 1 מ"ל של התרבות חיידקים (0.5-1.0 OD ב 600 ננומטר) בשעה RCF 800 עד 4500. בהתאם חיידקים, השתמש RCF המינימום גלולה יהיה התאים ~ 5 דקות.
2. שטפו את גלולה בהיקף זהה של מים מסוננים או deionized חיץ.
3. איסוף התאים שוב על ידי צנטריפוגה.
4. Resuspend את הכדור מיד ב 500 μL מים deionized חיץ nanopure או. (השעיה חיידקי צריך להיות עכור בעליל כדי שיהיה ריכוז מספקת של תאים עבור הדמיה AFM).
5. החל את ההשעיה תא (10-20 μL) כדי מיקה ג'לטין מצופה ולהתפשט על פני השטח באמצעות קצה פיפטה (איור 1 ג'). יש להקפיד לא לגעת פיזית את פני השטח ג'לטין עם קצה פיפטה תוך יישום או להפיץ את פתרון חיידקי.
6. אפשר המשטח לנוח למשך 10 דקות ולשטוף עם זרם מים או חיץ (איור 1 cd). לאורך כל ההליך, דואגים להבטיח כי המדגם אינו רשאי יבש.

5. נציג תוצאות:

תרשים 2 מציג תמונות דוגמה תאים חיידקיים כי כבר רכוב על מיקה ג'לטין מצופה הדמיה על ידי AFM. במעבדות שלנו, דגימות הם צילמו בדרך כלל באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי PicoPlus (Agilent Technologies, בית המקדש, AZ) לבוש עם ראש מיקרומטר 100 סריקה. המכשיר מופעל על 128-512 פיקסלים לכל לסרוק קו במהירות סריקה של 0.5-1.0 קווי / s. Cantilevers המשמשים בדרך כלל הם Veeco בדיקות סיליקון ניטריד (MLCT-AUHW, Veeco, סנטה ברברה, קליפורניה) עם קבועי קפיץ הנומינלי החל 0.01-0.1 NN / ננומטר.

באיור 1. לטין בטמפרטורה של 60-70 מעלות צלזיוס ממוקם כוס 20 מ"ל. בעזרת פינצטה טרי ביקע ריבועים מיקה שקועים לגמרי לתוך הג'לטין (א) מכונס העמידו על מגבת נייר נשען על מדף צנטריפוגות מיקרו (ב). אגל של המדגם חיידקי מושם על מיקה ושל התפשטות עם טיפ pipet הן X ו Y כיוונים (ג). לאחר המאפשר המדגם כדי לדגור על פני השטח מיקה לפחות 10 דקות, לשטוף את המדגם בזרם של מים מזוקקים. אם immobilization עבדו תוכל לראות את המקום אטום על מיקה כפי שמוצג בלוח השמאלי של (ד). אם immobilization לא לעבוד תקבלו חתיכת ברורה של מיקה כמו בלוח השמאלי. הנקודה אטום על המאזניים מיקה ריכוז של חיידקים בתוך אגל לך מקום על מיקה התייחסו ג'לטין.

2. איור AFM תמונות של א coli. בלוח (א), התאים הם רכובים על מיקה ג'לטין מצופה הדמיה ב 0.005 M-PBS. לשם השוואה, דימוי של תאים חיידקיים רכוב על מיקה ג'לטין מצופה הדמיה באוויר מוצג בלוח (ב). למרות septa הם בבירור בתמונה שנאספו נוזלי, ברזולוציה גדולה יותר, כפי שצוין על ידי נוכחות של פילי (פאנל הבלעה (ב)), ניתן להשיג באוויר.

Discussion

גורמים שונים יכולים להשפיע על התא של חיידקים הרכבה הדמיה באמצעות AFM. ג'לטין המשמש לציפוי מיקה חשוב. מסחרי ג'לטין מבודד ממספר חוליות כולל דגים, פרות וחזירים. שניהם מקורם ואת שיטת עיבוד לקבוע התאמתו של ג'לטין עבור immobilization חיידקי. מקורות רבים וסוגי ג'לטין הוערכו ע...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם	חברה	מספר קטלוגי
לטין	סיגמא, סנט לואיס, מיזורי	G6144, G2625 או G2500
PicoPlus מיקרוסקופ כוח אטומי	Agilent Technologies, בטמפה, AZ
AFM cantilevers	Veeco, סנטה ברברה, קליפורניה	MLCT-AUHW